УДК 581.1
АПОПТОЗОПОДОБНАЯ ДЕГРАДАЦИЯ ПЫЛЬЦЕВЫХ ЗЕРЕН У Scilla sibirica СВЯЗАНА С ОТСУТСТВИЕМ ПОНИЖЕННЫХ ТЕМПЕРАТУР ПРИ ИХ РАЗВИТИИ
 © 2009 г. Е. А. Мирославов, Е. М. Бармичева
Ботанический институт им. В.Л. Комарова Российской академии наук,
Санкт-Петербург
Поступила в редакцию 23.06.2008 г.
Для прохождения полного цикла развития пыльников ранневесенних эфемероидов необходима пониженная температура. Проведено сравнительное изучение пыльцевых зерен Scilla sibirica L., растущей в естественных условиях в парке и на холодное время года перенесенной в оранжерею. У контрольных растений (в открытом грунте) развитие микроспор осуществляется стандартным путем. Особи, перенесенные в оранжерею, резко отличались от контроля. У них к середине ноября около оболочки ядра генеративной клетки формировались скопления конденсированного хроматина. У некоторых митохондрий система крист редуцировалась. В декабре все митохондрии имели редуцированную систему крист. В матриксе некоторых митохондрий обнаружили довольно крупные везикулы, а в их оболочках  разрывы. В вегетативной и генеративной клетках формировались автофаговые вакуоли. Автофаговые вакуоли находились и в теле самого ядра; в результате вакуолизация клеток пыльцевых зерен резко возрастала. В январе во всех пыльцевых зернах выявляли лишь продукты лизиса протопласта. Сделан вывод, что у пролески отсутствие пониженных температур вызвало апоптозоподобную деградацию клеток пыльцевых зерен.

---------------------------------------
Адрес для корреспонденции: Мирославов Евгений Аркадьевич. 197376 Санкт-Петербург, ул. проф. Попова, 2. Ботанический институт РАН, лаборатория анатомии. Электронная почта: miroslavov@mail.ru
 Ключевые слова: Scilla sibirica  апоптоз  вегетативная клетка  генеративная клетка  микроспора  митохондрия  открытый грунт  оранжерея  пыльник  пыльцевое зерно.

ВВЕДЕНИЕ

Для прохождения полного цикла развития ранневесенним эфемероидам необходима пониженная температура [16].
Ранее в морфогенезе пролески, перенесенной на холодное время года из грунта в оранжерею, наблюдали значительные отклонения от контроля [7, 8]. Прежде всего, они касались вегетативных структур, в частности, чешуй и донца луковицы. Однако до настоящего времени изучение субмикроскопического строения клеток пыльника в таких случаях не проводилось. Вместе с тем, такие сведения в какой-то мере могли бы помочь в выявлении структурных основ реакции клетки на пониженные температуры и расширении наших представлений о биологии развития чрезвычайно интересной и своеобразной категории растений – ранневесенних эфемероидов.

МЕТОДИКА

В качестве объекта исследования были взяты развивающиеся пыльники ранневесеннего эфемероида  пролески (Scilla sibirica L.), постоянно растущей в парке Ботанического института им. В.Л. Комарова РАН, и для сравнения  пыльники растений, перенесенных в ноябре в оранжерею. Брали пыльники на разной стадии развития, начиная с 1 ноября до апреля. Материал фиксировали в смеси 2.5% параформальдегида ("Serva", Германия) и 2% глутаральдегида ("Serva") на 0.1 М фосфатном буфере (pH 7.4), затем отмывали в этом же буфере в течение 1 ч и повторно фиксировали в 2% OsO4, приготовленном на том же буфере, в течение 34 ч при комнатной температуре. После фиксации осмием образцы промывали сначала в серии спиртов с повышающейся концентрацией, затем в абсолютном ацетоне, после чего заливали эпоксидной смесью аралдит М-эпон 812 ("Fluka", Швейцария).
Срезы готовили на ультратоме LKB-III. Полутонкие срезы окрашивали 0.1% толуидиновым синим. Ультратонкие срезы окрашивали 3.5% уранилацетатом на ацетатном буфере и цитратом свинца [9]. Ультратонкие срезы фотографировали под электронным микроскопом Hitachi-H600.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Структура пыльцевых зерен растений, растущих в открытом грунте

Ноябрь. Изучение строения пыльцевых зерен растений, растущих в открытом грунте, начали с 1 ноября, т.е. со времени перенесения партии луковиц из парка в оранжерею. В это время двухклеточные пыльцевые зерна находились на стадии вакуолизации. Генеративная клетка мелкая. Почти весь ее объем занимало ядро. Значительную часть площади среза ядра занимал конденсированный хроматин. Цитоплазма в виде тонкого слоя окружает ядро. Оболочка, разделяющая генеративную и вегетативную клетки, представлена двумя мембранами, имеющими многочисленные довольно глубокие складки. Вегетативная клетка значительно крупнее генеративной. Ядро вегетативной клетки по своим размерам сопоставимо с ядром генеративной клетки. Пластиды представлены единичными амилопластами, имеющими крахмальные зерна. Митохондрии многочисленны с хорошо развитой системой крист, они образуют скопления. Эндоплазматический ретикулум развит слабо. Выявлены лишь отдельные профили срезов его цистерн, мембраны которых несут редко расположенные рибосомы.
Аппарат Гольджи также развит слабо. Диктиосомы выявляли с большим трудом и далеко не на каждом срезе пыльцевого зерна. Судя по числу отчленяющихся от цистерн пузырьков, первые имели невысокую активность. Рибосомы, как правило, представлены моносомами. Обнаружены липидные капли и мелкие вакуоли с электронно-прозрачным содержимым.
Декабрь. В складках оболочки, разделяющей вегетативную и генеративную клетки, обнаружены крупные липидные капли, практически вплотную прилегающие друг к другу. Амилопласты буквально забиты крахмальными зернами. Вакуоли отсутствовали.
В январе и феврале строение пыльцевых зерен практически не отличалось от того, которое мы наблюдали в декабре (рис. 1а).

Строение пыльцевых зерен растений, перенесенных в оранжерею

Ноябрь. После перенесения луковиц в оранжерею уже через десять дней (11 ноября) около оболочки ядра генеративной клетки формировались скопления конденсированного хроматина (рис. 1б). По размерам они довольно сильно варьировали. Возможно, это зависело от того, в какой части этих скоплений прошел срез. Матрикс некоторых митохондрий сильно просветлялся (рис. 1в). Число крист в таких митохондриях сравнительно низкое.
Декабрь. Со временем разрушение митохондрий продолжалось. В декабре митохондрии, имеющие типичное строение, не обнаружены. Все они в той или иной мере были деградированы. У некоторых кристы практически полностью разрушены, матрикс сильно просветлен, в нем выявлялись пузыревидные образования (на рис. 1г показано стрелкой). Кроме того, выявлялись митохондрии, оболочки которых образовывали пузыревидные выросты, ограниченные одинарной мембраной (рис. 1е). Встречались и митохондрии с оболочкой, имеющей разрывы (рис. 1д). Отличалась своеобразием и топография митохондрий. В вегетативной клетке они тяготели к ядру, плотно прилегая к его оболочке и одна к другой (рис. 1ж).
Существенные изменения происходили и в строении амилопластов. Они оказывались как бы сдавленными с разных сторон вакуолями и теряли свою обычную форму. Число и размеры крахмальных зерен в них значительно снижались.
К декабрю в вегетативной клетке выявляются и автофаговые вакуоли (рис. 2а). Вакуолизация клетки существенно увеличивалась. Вакуоли формировались и в генеративной клетке, прежде всего, в ее тончайшем слое цитоплазмы, окружающем ядро (рис. 2б). При этом они плотно прилегали к ядру, и между ним и вакуолями не выявлялось никаких органелл. Кроме того, вакуоли могли внедряться и в тело ядра, в образовавшиеся в нем инвагинации (рис. 2б). В результате столь сильной вакуолизации генеративной клетки оболочка, разделяющая генеративную и вегетативную клетки, отходила от ядра и в некоторых случаях разрушалась. Автофаговые вакуоли обнаруживались не только в цитоплазме, но и в ядре генеративной клетки (рис. 2в).
Январь. Протопласт всех пыльцевых зерен полностью разрушался. Были выявлены лишь оболочки пыльцевых зерен и продукты лизиса их протопласта (рис. 2г).
Таким образом, в контрольном варианте формирование пыльцевых зерен у S. sibirica начиналось с осени и заканчивалось весной. У растений же, перенесенных в оранжерею, в январе наблюдали полную деструкцию пыльцевых зерен. В первую очередь, различия обнаруживали в структуре ядра. После перенесения луковиц в оранжерею уже через десять дней около оболочки ядра генеративной клетки формировались скопления конденсированного хроматина. Этот признак является типичным для процессов апоптоза. В частности, он обнаружен в клетках тапетума Tillаndsia albida [10], а также в замыкающих клетках устьиц листа Pisum sativum при воздействии цианида – одного из индукторов апоптоза у растений [11]. Кроме того, при программированной клеточной смерти отмечается и общее повышенное содержание конденсированного хроматина [12, 13]. Описанная особенность строения ядра является структурным признаком апоптоза и для животных клеток [14].
Существенные изменения происходили и в строении митохондрий. При взятии проб 11 ноября у некоторых митохондрий матрикс в значительной мере просветлялся и численность крист снижалась, тогда как остальные органеллы имели обычное строение. Позднее (15 декабря) все митохондрии имели редуцированную систему крист и просветленный матрикс. У некоторых из них в просветленном матриксе выявлялись пузыревидные образования. Такие структуры описаны в клетках тапетума Lilium [15, 16]. Как известно, для этого типа ткани и в норме характерен апоптоз. Clement с соавт. [15] считают, что пузыревидные образования  это автофаговые вакуоли. В декабре в вегетативной клетке обнаруживали и митохондрии, оболочки которых имели пузыревидные выпячивания, ограниченные элементарной мембраной, а также митохондрии, имеющие локальные разрывы оболочки. Как нам представляется, описанные явления являются цепью одного процесса от просветления матрикса и редукции крист до полного разрушения оболочки.
В вегетативной клетке пролески полуразрушенные митохондрии буквально чехлом окружали ядро, плотно прилегая друг к другу и к ядру. У гороха в процессе апоптоза замыкающих клеток устьиц, вызванного цианидом, ядра в некоторых местах утрачивали оболочку. На таких участках митохондрии имели непосредственный контакт с хроматином [9]. Такой картины мы в своей работе не выявили. Вместе с тем, непосредственные контакты митохондрий с оболочкой ядра – явление не случайное. В контроле (образцы, взятые в естественных условиях произрастания) подобного явления не обнаружили.
Митохондрии играют важную роль в программируемой клеточной смерти [1720]. В процессе апоптоза ряд растворимых белков выходит из митохондрий в цитоплазму, в том числе, и цитохром с, являющийся апоптогенным фактором [12]. По данным Скулачева [21], выход цитохрома с осуществляется через крупные поры, образующиеся в наружной мембране митохондрии. Тем не менее, пути и механизмы выхода цитохрома с из митохондрий все еще изучены мало [17].
Существенные различия выявляются и в степени вакуолизации пыльцевых зерен. У растений, растущих в открытом грунте, стадия вакуолизации пыльцевых зерен практически заканчивалась в декабре. У особей, перенесенных в оранжерею, напротив, с декабря вакуолизация усиливалась. В декабре в вегетативной клетке образовывались автофаговые вакуоли. Сначала в них еще выявлялись продукты лизиса цитоплазмы; потом они исчезали. Вакуоль не имела никаких включений и становилась электронно-прозрачной. Автофаговые вакуоли образовывались и в генеративной клетке в тончайшем пристенном слое цитоплазмы, постепенно увеличиваясь. В результате оболочка, разделяющая вегетативную и генеративную клетки, отходила от ядра. Иногда можно было наблюдать и ее разрывы. Сами же вакуоли плотно прилегали к ядру, нередко внедряясь и в его тело. Кроме того, вакуоли могли контактировать между собой. Создается картина, сходная с таковой в вегетативной клетке. В последнем случае образовывалась обкладка тесно прилегающих друг к другу митохондрий, а в генеративной клетке – вакуолей. Более того, автофаговые вакуоли выявлялись даже в ядре. В таких ядрах очень трудно было выявить хроматин. Вместе с тем, ядро можно с полной уверенностью идентифицировать, ориентируясь как на оболочку, разделяющую генеративную и вегетативную клетки, так и на наличие липидных капель, находящихся в складках оболочки. У пролески они плотно прилегают к оболочке, образуя сплошное кольцо. Как известно, автофаговые вакуоли содержат различные гидролитические ферменты и при определенных условиях они могут перемещаться в цитоплазму, вызывая ее разрушение [22, 23]. Экспериментально доказано, что у растений лизис протопласта играет ведущую роль в программированной клеточной смерти [24].
Кроме описанных явлений мы отмечали и деструкцию пластид. Нередко наблюдали картины, когда вакуоли как бы вдавливались в амилопласт. Последний терял свою правильную форму, а число и размеры крахмальных зерен снижались. В январе ядро и все органеллы полностью разрушались.
Таким образом, у ранневесеннего эфемероида пролески в отсутствие пониженных температур происходила апоптозоподобная деградация пыльцевых зерен, приводящая к их гибели. Уже через полторадва месяца в клетках пыльцевых зерен формировались апоптозоподобные признаки. Следовательно, для нормального развития пыльцевых зерен были необходимы пониженные температуры, при содержании же растений в оранжерее изменялся сложившийся за время их эволюции термопериод. Как известно, термопериод существенно влияет на развитие вегетативных органов [25]. На формирование репродуктивных структур он, вероятно, оказывает еще большее влияние. При отсутствии осенне–зимних пониженных температур у ранневесенних эфемероидов, в том числе и у пролески, практически полностью выпадала фаза цветения. Дело в том, что между формирующимися пыльцевыми зернами и клетками тапетума, для которых в норме характерен апоптоз, происходит строго синхронизированный обмен различными веществами. Как говорят физиологи, осуществляется "биохимический диалог" [26]. При изменении термопериода такая сложная система может дать сбой. Это, в свою очередь, скажется на формировании клеток пыльцевого зерна и даже спермия, т.е. возникнут очень серьезные отклонения от нормального развития. В такой ситуации могут сработать механизмы программированной клеточной смерти, поскольку они призваны способствовать нормальному развитию биологических систем [12].
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 06-04-49028).
 

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Горышина Т.К. Регулирование ритма сезонного развития ранневесенних дубравных эфемероидов в экспериментальных условиях // Физиология растений. 1965. Т. 12. С. 549-550.
2. Горышина Т.К. О динамике температурных оптимумов у гусиного лука (Gagea lutea (L.) Ker–Gawl) в период покоя // Науч. докл. высш. школы. Биологические науки. 1965. № 12. С. 136-139.
3. Скрипчинский В.В., Скрипчинский Вл.В., Шевченко Г.Т. Роль температуры в годичном цикле развития весенних геофитов Северного Кавказа // Ботан. журн. 1968. Т. 53 С. 1233-1245.
4. Скрипчинский В.В., Скрипчинский Вл.В. Морфологические основы онтогенеза геофитов и проблема его эволюционного становления // Тр. МОИП. 1976. Т. 42. С. 167-185.
5. Lambrects H., Rook F., Kollöffel Chr. Carbohydrate Status of Tulip Bulbs during Cold-Induced Flower Stalk Elongation and Flowering // Plant Physiol. 1994. V. 104. P. 515-520.
6. Van der Toorn A., Zemah H., van As H., Bende P., Kamenetsky R. Developmental Changes and Water Status in Tulip Bulbs during Storage: Visualization by NMR Imaging // J. Exp. Bot. 2000. V. 51. P. 1277-1287.
7. Мирославов Е.А., Бармичева Е.М., Ходорова Н.В. Сезонные изменения структуры клеток основной ткани донца луковицы Scilla sibirica (Liliaceae) // Ботан. журн. 2005. Т. 90. С. 1430-1435.
8. Мирославов Е.А., Бармичева Е.М. Сезонная ритмика структуры лейкопластов чешуй луковицы Scilla sibirica L. // Цитология. 2005. Т. 47. С. 1035-1038.
9. Reynolds E.S. The Use of Lead Citrate at High pH as an Electron-Opaque Stain in Electron Microscopy // J. Cell Biol. 1967. V. 17. P. 208-212.
10. Papini A., Mosti S., Brighigna L. Programmed-Cell-Death Events during Tapetum Development of Angiosperms // Protoplasma. 1999. V. 207. P. 213-221.
11. Бакеева Л.Е., Дзюбинская Е.В., Самуилов В.Д. Программируемая клеточная смерть у растений: ультраструктурные изменения в устьичных клетках гороха // Биохимия. 2005. Т. 70 C. 1171-1185.
12. Самуилов В.Д., Олескин А.В., Лагунова Е.М. Программируемая клеточная смерть // Биохимия. 2000. Т. 65. С. 1029-1046.
13. Gunawardena A.H.L.A.N., Sault K., Donelly P., Greenwood J.S., Dengler N.G. Programmed Cell Death and Leaf Morphogenesis in Monstera oblique (Araceae) // Planta. 2005. V. 221. P. 607-618.
14. Новожилова А.П., Плужников Н.Н., Новиков В.С. Механизмы клеточной смерти: проблемы и перспективы // Программированная клеточная гибель / Под ред. Новикова В.С. СПб.: Наука, 1996. С. 9-30.
15. Clement C., Laporte P., Audran J.C. The Loculus Content and Tapetum during Pollen Development in Lilium // Sex Plant Reprod. 1998. V. 11. P. 94-106.
16. Varnier A.-L., Mazeyrat-Gourbeyre Fl., Sangwan R.S., Clement Chr. Programmed Cell Death Progressively Models the Development of Anther Sporophytic Tissues from the Tapetum and Is Triggered in Pollen Grains during Maturation // J. Struct. Biol. 2005. V. 152. P. 118-128.
17. Ванюшин Б.Ф. Апоптоз у растений // Успехи биол. химии. 2001. Т. 41. С. 3-38.
18. Lam E., Kato N., Lawton M. Programmed Cell Death, Mitochondria and Plant Hypersensitive Response // Nature. 2001. V. 411. P. 848-853.
19. Yao N., Eisfelder B.J., Marvin J., Greenberg J.T. The Mitochondrion – an Organelle Commonly Involved in Programmed Cell Death in Arabidopsis thaliana // Plant J. 2004. V. 40. P. 596-610.
20. Vianello A., Zancani M., Peresson C., Petrussa E., Casolo V., Krajňáková J., Patui S., Braidot E., Macri F. Plant Mitochondrial Pathway Leading to Programmed Cell Death // Physiol. Plant. 2007. V. 129. P. 242-252.
21. Скулачев В.П. Явление запрограммированной смерти. Митохондрии, клетки и органы: роль активных форм кислорода // Соросовск. образов. журн. Биология. 2001. Т. 7. № 6. C. 4-11.
22. Hatsugai N., Kuroyanagi M., Yamada K., Meshi T., Tsuda S.H., Kondo M., Nishimura M., Hara-Nishimura I. A Plant Vacuolar Protease, VPE, Mediates Virus-Induced Hypersensitive Cell Death // Science. 2004. V. 305. P. 855-858.
23. Hatsugai N., Kuroyanagi M., Nishimura M., Hara-Nishimura I. A Cellular Suicide Strategy of Plants: Vacuole-Mediated Cell Death // Apoptosis. 2006. V. 11. P. 905-911.
24. De Jong A.J., Hoeberichts F.A., Yakimova E.T., Maximova E., Woltering E.J. Chemical-Induced Apoptotic Cell Death in Tomato Cells: Involvement of Caspase-Like Proteases // Planta. 2000. V. 211. P. 656-662.
25. Марковская Е.Ф., Сысоева М.И. Роль суточного температурного градиента в онтогенезе растений. М.: Наука, 2004. 119 с.
26. Mascarenhas J.P. The Biochemistry of Angiosperm Pollen Development // Bot. Rev. 1975. V. 41. P. 259-314.

 ПОДПИСИ К РИСУНКАМ
Рис. 1. Пыльцевое зерно и его фрагменты.
а – общий вид пыльцевого зерна; б – ядро генеративной клетки; ве – митохондрии вегетативной клетки; ж – фрагмент цитоплазмы около вегетативного ядра. Стрелкой на рисунках (а) и (б) показана оболочка, разделяющая генеративную и вегетативную клетки. Стрелкой на рис. (г) и (д) показана интрамитохондриальная гранула. а – фиксация 19 февраля, парк; б, в – фиксация 11 ноября, оранжерея; гж – фиксация 15 декабря, оранжерея.
А – амилопласт; В – вакуоль; ВК – вегетативная клетка; ГК – генеративная клетка; КО – клеточная оболочка пыльцевого зерна; КХ – скопления конденсированного хроматина; Л – липидная капля; М – митохондрия; ЭР – эндоплазматический ретикулум; Я – ядро.

Рис. 2. Фрагменты клеток пыльцевого зерна.
а – автофаговая вакуоль в вегетативной клетке; б, в – разрушающиеся ядра генеративной клетки; г – пыльцевое зерно с разрушенным протопластом. а–в – фиксация 15 декабря, оранжерея; г – фиксация 24 января, оранжерея. АВ – автофаговая вакуоль; Ц – разрушенный протопласт. Остальные обозначения такие же, как и на рис. 1.