УДК 581.1
ЭНДОНУКЛЕАЗЫ И ИХ УЧАСТИЕ В АПОПТОЗЕ РАСТЕНИЙ
© 2009 г. Н. И. Александрушкина, Б. Ф. Ванюшин
Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва
Поступила в редакцию 26.08.2008 г.
В обзоре рассмотрены современные сведения о природе, наборе, специфичности действия и других свойствах растительных эндонуклеаз, в основном, участвующих в различных формах запрограммированной клеточной гибели (ЗГК) в разных тканях (органах) растений. Апоптоз ( обязательный элемент онтогенеза растений; без него нормальное развитие растений невозможно, и кроме того в зависимости от тех или иных условий произрастания этот процесс может быть индуцирован разными биологическими и абиогенными, в том числе стрессовыми, факторами. Эндонуклеазам, осуществляющим апоптозную деградацию ядерного материала в растительной клетке, отводится одна из ведущих ролей в исполнении запрограммированной клеточной гибели. Эндонуклеазы растений принадлежат по меньшей мере к двум классам: 1) Са2+-, Mg2+- и 2) Zn2+-зависимые нуклеазы. Набор и активности эндонуклеаз тканеспецифично изменяются с возрастом растения и при апоптозе. Апоптоз сопровождается индукцией специфических эндонуклеазных активностей, осуществляющих гидролиз ДНК в хроматине с возникновением сначала крупных фрагментов (доменов), а затем межнуклеосомную фрагментацию ДНК с образованием продуктов длиной около 140 нуклеотидов и последующую их деградацию до низкомолекулярных олигонуклеотидов и мононуклеотидов. В апоптозной деградации ДНК участвуют около тридцати эндонуклеазных энзиматических активностей. Действие эндонуклеаз модулируется гистоном Н1, отдельные (суб)фракции этого ядерного белка могут стимулировать или ингибировать соответствующие эндонуклеазы растений. В ядре и цитоплазме клеток растений впервые выявлены и описаны Са2+-, Mg2+-- зависимые эндонуклеазы, которые распознают субстратные ДНК по статусу их метилирования и действие которых подобно бактериальным эндонуклеазам рестрикции модулируется донором метильных групп в клетке S-аденозилметионином. Это указывает на возможное существование у высших эукариот (высшие растения) системы рестрикции ( модификации в какой-то степени аналогичной прокариотическим системам.

Ключевые слова: растения - запрограммированная гибель клеток - эндонуклеазы.
---------------------------------------
Сокращения: ГЧО ( гиперчувствительный ответ, ЗГК ( запрограммированная гибель клеток, ТЭ - трахеальные элементы, dsДНК - двухтяжевая ДНК, RM-системы - системы рестрикции(модификации, SAM ( S-аденозилметионин, ssДНК ( однотяжевая ДНК, SSP-нуклеазы - нуклеазы, преимущественно разрушающие однотяжевые ДНК.
Адрес для корреспонденции: Ванюшин Борис Федорович. 119992 Москва, Ленинские горы, д. 1, стр.40. Научно-исследовательский институт физико-химической биологии, Московский государственный университет. Факс: 007 (495) 939-31-81; электронная почта: vanyush@belozersky.msu.ru

ВВЕДЕНИЕ

Эндонуклеазы играют важную роль в процессах, объединенных символом "4 Р" (репликация, репарация, рекомбинация и рестрикция). Изучение запрограммированной клеточной гибели (ЗГК) добавило нуклеазам еще одну важную для жизнедеятельности одно- и многоклеточных организмов функцию ( участие в реализации программы ЗГК, в том числе деструкции ядра.
К настоящему времени наиболее подробно изученной формой ЗГК является апоптоз ( один из основополагающих процессов в жизни многоклеточного организма; он обязателен как для развития организма в целом, так и для поддержания клеточного гомеостаза. Впервые апоптоз был описан в 1972 г. Kerr с соавт. [1] и определен ими как "…механизм контроля клеточных повреждений, который выполняет комплементарную или противоположную митозу роль в регуляции жизнедеятельности клеточной популяции".
Одним из надежных маркеров апоптоза служит межнуклеосомная фрагментация ядерной ДНК, впервые описанная Wyllie [2] при изучении индуцированного глюкортикоидами апоптоза у тимоцитов. Интересно, что "межнуклеосомную лестницу" фрагментов ДНК наблюдали десятью годами раньше [3], за четыре года до появления доказательства нуклеосомной организации хроматина, и ее появление на определенных стадиях развития вовсе не связывали с клеточной гибелью. С эволюционной точки зрения нуклеосомная упаковка хроматина является важным регуляторным и компактизирующим генетический материал фактором в живой клетке, а в гибнущей клетке хроматин становится менее компактным и подготовленным к превращению в мононуклеосомные фрагменты апоптозными эндонуклеазами и для последующего эффективного гидролиза ДНК [4].
Ферменты, осуществляющие деградацию ДНК при апоптозе, обычно относят к двум группам: (1) автономные клеточные нуклеазы, которые гидролизуют собственную ДНК внутри гибнущей клетки и (2) нуклеазы-"мусорщики", участвующие в деградации ДНК как во внеклеточном пространстве, так и в фагоцитах, поглощающих у животных осколки разрушенных клеток. Однако теоретически возможно, что секретируемые или лизосомные нуклеазы могут при определенных обстоятельствах высвобождаться в цитоплазму собственной клетки и гидролизовать свою ДНК [5].
К настоящему времени имеются сообщения об участии в апоптозной деградации ДНК, по крайней мере, около тридцати энзиматических активностей; некоторые из них приведены в таблице.
После известного обзора Sugiyama с соавт. [6] работ, обобщающих сведения о нуклеазах, осуществляющих деградацию ДНК при ЗГК у растений, не появлялось, и это отчасти объясняется тем, что на первый план вышли исследования, связанные с выяснением механизмов и путей инициации программ клеточной гибели, с целью детальной классификации форм клеточной гибели. С другой стороны, накопленные за последние годы сведения еще не позволяют сделать четкие выводы относительно участия конкретных ферментов или наборов ферментов в том или ином типе ЗГК.
Мы попытались суммировать данные последних лет о нуклеазах ( исполнителях завершающей стадии различных ЗГК растений.

НУКЛЕАЗЫ, УЧАСТВУЮЩИЕ В ЗГК В РАЗНЫХ ОРГАНАХ
ПРИ РАЗВИТИИ РАСТЕНИЙ

Растения используют ЗГК как один из механизмов, который необходим для нормального развития в ходе онтогенеза. ЗГК в жизненном цикле наблюдается при дифференцировке специализированных типов клеток, таких как трахеальные элементы, удалении тканей с эфемерными функциями, например, суспенсора и тапетума, и органоморфогенезе во время образовании функционально однополых цветков из бисексуального примордия или при формообразовании листьев. Разнообразие органов и тканей, при развитии которых наблюдается избирательное удаление выполнивших свою функцию или препятствующих нормальному морфогенезу клеток, предполагает функционирование различных программ клеточной гибели, которые классифицируются по морфотипу на апоптоз, апоптозоподобную клеточную гибель, аутофагию и контролируемый некроз. Молекулярные механизмы реализации этих программ остаются малоизученными, в том числе это относится и к процессу деградации носителя генетической информации - ядерной ДНК. Сравнительный анализ ферментов, осуществляющих деструкцию ДНК при ЗГК в ходе развития растений, необходим для расшифровки особенностей этих программ, их четкой классификации и выяснения сходства и различий этих процессов у животных и растений [7, 8].
Тапетум

Разрушение тапетума, внутреннего слоя клеток, выстилающих пыльник, классифицируют как ЗГК на завершающих стадиях развития пыльцы. Содержимое клеток тапетума, как полагают, используется для формирования оболочек спор (гетеротрофный рост микроспор) и способствует их высвобождению из пыльника [9]. В 80-х годах из пыльцы одно- и двудольных растений были выделены бифункциональные нуклеазы (ДНКазы/РНКазы); однако не было предпринято попыток очистить и идентифицировать эти ферменты. Интерес к этим нуклеазам вновь возник в связи с обнаружением Mg2+-зависимой нуклеазной активности в диффузатах одноядерных микроспор ячменя [10]. Затем из микроспор ячменя была выделена Mg2+-зависимая нуклеаза BMN (мол. м. 34 кД), активность которой максимальна при рН = 5.6. BMN стабильна в интервале рН 4.0-8.0 и при температуре до 50ºС. Инкубация BMN с интактными ядрами ячменя вызывает межнуклеосомную фрагментацию хроматина. Анализ субстратной специфичности BMN показал, что фермент преимущественно использует в качестве субстрата однотяжевую ДНК (ssДНК); однако он гидролизует и РНК. Кроме того, BMN гидролизует poly(dA) и poly(A), тогда как poly(dC), poly(С), poly (G) и poly (I) расщепляются им гораздо слабее, что указывает на выраженную специфичность по отношению к адениновым остаткам - типичной мишени для многих известных растительных нуклеаз. На вопрос о влиянии типа сахара в гомополимерах на их деградацию был получен неоднозначной ответ: при одинаковой глубине гидролиза poly(dA) и poly(A) полинуклеотид poly(dС) гидролизуется гораздо слабее, чем poly(С). Принимая во внимание зависимость BMN от Mg2+, эта нуклеаза не может быть отнесена к группе S1 нуклеаз. Однако, как и S1 нуклеазы, BMN является гликопротеином, молекулярная масса этого фермента около 30(40 кД, для нее несущественен тип сахара в молекуле субстрата. Предполагается, что BMN осуществляет деградацию ДНК в клетках тапетума во время сегрегации тетрад [11].
При анализе экспрессии генов нуклеаз Bnuc1 и BEN ячменя в развивающихся пыльниках найден экспрессирующийся ген еще одной нуклеазы (Bnuc2), максимальная активность которой наблюдалась на стадии тетрад [12]. Интересным с точки зрения участия в этом процессе нуклеазы тапетума представляется абортация половых клеток в однополых цветках Actinidia deliciosa. Развитие пыльцы идет одинаково как в женских, так и в мужских цветках до момента высвобождения микроспор из тетрад. Затем в них наблюдаются конденсация и сжатие цитоплазмы, сморщивание цитоплазматической мембраны и ядерной оболочки, а также конденсация хроматина и фрагментация ядерной ДНК, выявленная in situ TUNEL-методом; на фоне этих событий клеточные органеллы, в том числе митохондрии, сохраняют свою структуру [13]. Очевидно, что наблюдаемое явление может быть отнесено к ЗГК. При этом важно выяснить, активируются ли собственные ДНКазы в деградирующих микроспорах и/или в этом принимает участие ДНКаза тапетума, активация которой совпадает по времени со стадией образования тетрад.
Суспенсор

В результате первого деления зиготы у цветковых растений образуются две неравноценные клетки, судьба которых различна. Из меньшей клетки формируется зародыш, а бóльшая по размеру клетка после определенного числа делений дифференцируется в суспенсор. По достижении зародышем стадии "семядоли" суспенсор прекращает функционировать и разрушается [14]. Деградация терминально дифференцированного суспенсора считается одним из наиболее типичных примеров ЗГК при развитии растений [15]. Это подтверждается присутствием характерных для апоптозоподобной ЗГК маркеров - появлением TUNEL-позитивных клеток и деградацией ДНК до олигонуклеосомных фрагментов [16], высвобождением цитохрома с из митохондрий и индукцией каспазоподобных протеиназ, которые чувствительны к рН и специфическим ингибиторам, что продемонстрировано на примере Phaseolus coccineus [17].

Нуцеллюс

Деградация нуцеллярной ткани (материнские клети, выстилающие зародышевый мешок и отмирающие на ранних стадиях развития зародыша) является еще одним примером ЗГК при развитии растений. В нуцеллюсе развивающихся зерновок пшеницы выявлены характерные признаки ЗГК - положительная реакция на наличие фрагментации ДНК (TUNEL-позитивные клетки) и межнуклеосомная фрагментация ДНК [18]. Аналогичные изменения ядерного содержимого при деструкции нуцеллюса были обнаружены у Ricinus communis [19]. В семенах Sechium edule деградация нуцеллюса также сопровождается характерными изменениями морфологии ядра, деградацией ДНК и активацией каспазоподобных протеиназ [20]. И, наконец, в нуцеллярных клетках зерновок пшеницы на 8(12-й день после оплодотворения идентифицирована нуклеаза, локализованная в ядрах гибнущих клеток [21]. Эта нуклеаза (мол. м. около 50 кД) характеризуется Са2+/Mg2+-зависимостью, имеет рН оптимум 7.0, ингибируется Zn2+ и ЭДТА. В цитоплазматической фракции гибнущих нуцеллярных клеток также была обнаружена нуклеазная активность, определяемая, скорее всего, несколькими нуклеазами, отличающимися от ядерной нуклеазы как по электрофоретической подвижности (от 30 до 38 кД), так и по характеру действия: она не способна гидролизовать ДНК в интактных ядрах из развивающегося эндосперма, тогда как ядерная нуклеаза (50 кД) вызывала в них межнуклеосомную фрагментацию ДНК. Нуклеазы из обеих субклеточных фракций расщепляли "голую" ДНК с образованием неспецифического размазывания ("шмера"). Нуклеаза из ядер деградирующего нуцеллюса также осуществляла олигонуклеосомную фрагментацию ДНК в интактных ядрах клеток НСТ116 человека, что можно рассматривать как указание на эволюционную близость процессов, происходящих на завершающих стадиях ЗГК у растений и животных [21].

Прорастание пыльцевой трубки

Прорастание пыльцевой трубки также сопровождается ЗГК так называемого "транзитного тракта". Этот процесс зависит от видовой принадлежности пыльцы и не включается при попадании чужеродной пыльцы [22]. У перекрестно опыляемых растений собственная пыльца гибнет при попадании на пестик за счет включения программы ЗГК в прорастающей пыльцевой трубке [23]. Для этих моделей ЗГК пока еще нет работ по определению и изучению нуклеаз-исполнителей.

Эндосперм и алейроновый слой зерновки злаков

Дегенерация эндосперма у злаков представляет собой одну из форм ЗГК; она проходит в несколько этапов, которые могут быть разделены во времени годами. На первом этапе при развитии зерновки в запасающих клетках эндосперма клеточное содержимое замещается на крахмал и запасные белки. Этот процесс проистекает асинхронно и не затрагивает поверхностные слои клеток, которые дифференцируются в клетки алейронового слоя, сохраняющего жизнеспособность в созревшем зерне [24]. У пшеницы и риса ядро первым из клеточных органелл подвергается дезинтеграции - оно распадается на многочисленные окруженные мембраной фрагменты. Однако после дезинтеграции ядра клетка остается жизнеспособной, в ней сохраняется высокая активность супероксиддисмутазы, каталазы, ферментов синтеза крахмала, продолжается накопление крахмала и запасных белков [25, 26]. В заполненных клетках эндосперма остаются фрагменты клеточных структур, в том числе и фрагменты ядра. Вторая стадия деградации связана с началом прорастания семян и активацией клеток алейронового слоя, секретирующих в эндосперм амилазу и другие гидролитические ферменты, осуществляющие окончательную деградацию запасающих клеток. Третья стадия деградации эндосперма связана с гибелью клеток алейронового слоя [27].
Первая стадия деградации эндосперма зерен кукурузы сопряжена с активацией эндонуклеаз с мол. м. 33.5, 36 и 38.5 кД, причем у мутанта shrunken2 с более интенсивной деградацией ДНК именно 33.5 кД нуклеаза ответственна за фрагментацию ДНК. Эти нуклеазы ( Са2+-зависимые ферменты с оптимумом рН 6.8 [28].
Из зерновок ячменя выделена и очищена до гомогенного состояния нуклеаза (нуклеаза 1), секретируемая клетками алейронового слоя на второй стадии деградации эндосперма [29]. Этот фермент ( гликопротеин с мол. м. 36 кД обладает РНКазной, ДНКазной и 3-нуклеотидазной активностями с оптимумом рН около 6.0 и температуры 60оС. Позднее ген этой нуклеазы был клонирован и обозначен как BEN1 [30]. При сравнении аминокислотной последовательности BEN1 (предсказанной, исходя из нуклеотидной последовательности кДНК) с аминокислотной последовательность N-концевого участка зрелого фермента (нуклеазы 1 ячменя) выявлен N-концевой сигнальный пептид. Динамика накопления мРНК BEN1 и возрастания активности нуклеазы, а также зависимость этих процессов от действия фитогормонов (ГК, АБК) указывают на de novo синтез BEN1 в алейроновом слое у прорастающих семян [30].
В активированных ГК протопластах из клеток алейронового слоя ячменя присутствуют по крайней мере три нуклеазы с мол. м. соответственно 33, 27 и 25 кД. Они появляются на второй день прорастания семян, и их активность достигает максимума на пятый день после гормонального воздействия. Нуклеазная активность (33 кД) была идентифицирована как "нуклеаза 1 ячменя ( BEN1" иммунологически, тогда как нуклеазы с мол. м. 27 и 25 кД не взаимодействовали с антителами к нуклеазе 1 ячменя. Все эти три нуклеазы гидролизуют ssДНК, РНК и dsДНК, они активируются Mn2+ и сильно ингибируются ЭДТА и ЭГТА [31].
ЗГК в клетках алейронового слоя на третьей стадии деградации эндосперма ассоциирована с конденсацией хроматина, межнуклеосомной фрагментацией ДНК под контролем ГК и его антагониста - АБК [32]. Максимальный уровень активности BEN1 и содержания мРНК BEN1 совпадает с началом деградации ДНК и TUNEL-мечения и в клетках алейронового слоя, что указывает на возможное участие BEN1 в ЗГК клеток алейрона [27]. Кроме того, было установлено, что перед началом фрагментации ДНК в ядрах клеток алейронового слоя, обработанных ГК, появляется нуклеаза, активируемая ионами Cа2+ и Mg2+, но ингибируемая Zn2+ с оптимум рН около 7.0 (мол. м. ядерной нуклеазы составляет примерно 30 кД). Эта нуклеаза индуцируется ГК, она не появляется при отсутствии синтеза фитогормона и у мутантов, утративших чувствительность к ГК. Предполагается, что подобно CAD эндонуклеазе животных клеток, перед транслокацией в ядро эта нуклеаза процессируется. В цитоплазме клеток алейронового слоя также было обнаружено несколько нуклеаз с мол. м. от 35 до 90 кД [33].

Мегагаметофит голосеменных

Гаплоидный мегагаметофит деградирует на ранних стадиях прорастания семян Picea glauca, причем деградация идет постепенно, и начинается она с клеток, прилегающих как к корешку на микропилярном конце семени, так и в глубинных слоях клеток халазального конца семени. Клеточная гибель сопровождается фрагментацией ядра, межнуклеосомным расщеплением ДНК и постепенной активацией нескольких нуклеаз. Выявленные при этом эндонуклеазы разделяются на две группы: на начальной стадии прорастания активируются нуклеазы (15, 17, 31 и 33 кД) с оптимумом рН в нейтральной области, а на завершающих стадиях деградации мегагаметофита индуцируются кислые нуклеазы (29, 43, 48, 62 и 73 кД). Все эти нуклеазы нуждаются в присутствии двухвалентных ионов (Ca2+, Mg2+ и Mn2+), но только нейтральные нуклеазы ингибируются ионами Zn2+. Функционирование кислых нуклеаз связывают с разрушением тонопласта [34].

Формообразование

Ремоделирование на клеточном, тканевом и органном уровнях реализуется растениями с использованием конкретных программ клеточной гибели (ЗГК) и происходит при дифференцировке трахеальных элементов, формировании лизогенной аэренхимы, развитии функционально однополых цветков и при морфогенезе листьев.

Формирование сосудистых путей

Терминальные стадии дифференцировки прокамбия в трахеальные элементы (ТЭ) является классическим примером ЗГК растений. Этот процесс подробно изучен in vivo и in vitro в культуре клеток мезофилла циннии, у которых определенное сочетание ауксина и цитокинина индуцирует синхронную дифференцировку в ТЭ [35, 36]. В этой модельной системе в клетках на стадии автолиза идентифицирована Zn2+-зависимая эндонуклеаза ZEN1 с мол. м. 43 кД [37]. Активность этой нуклеазы четко коррелировала с протеканием автолиза, а накопление мРНК данной нуклеазы происходило также специфическим образом, и по времени предшествовало началу автолиза [30]. Имеются прямые доказательства участия фермента ZEN1 в деградации ДНК во время ЗГК: содержащие ZEN1 клеточные экстракты способны гидролизовать яДНК циннии, антитела к ZEN1 лишают их этой активности, а инактивация гена ZEN1 антисмысловыми РНК подавляет деградацию яДНК, но не препятствует вакуолярному коллапсу. Одновременно с ZEN1 в клеточных экстрактах дифференцирующихся клеток при анализе in gel активности были обнаружены также Zn2+-зависимая 40 кД нуклеаза и Са2+/Mg2+-зависимые нуклеазы с мол. м. 29, 27 и 23 кД, функции которых пока неизвестны. Эти нуклеазы атакуют яДНК до появления вакуолярных Zn2+-зависимых нуклеаз [38].

Формообразование листьев

У сосудистых растений моделирование формы листьев (образование перфораций) явление достаточно редкое и наиболее основательно описано у представителей рода Monstera (сем. Аронниковые) и у Aponogeton madagascariensis. Этот процесс происходит на ранних этапах развития листьев и контролируется генетически, что позволяет рассматривать его как одну из форм ЗГК при развитии растений. Характерная особенность этого явления ( ЗГК в клетках удаляемой зоны листовой пластины проходит одновременно, при этом окаймляющие клетки остаются жизнеспособными. В гибнущих клетках происходит деградация яДНК: в ядрах клеток наблюдается TUNEL-положительная реакция, а электрофорез в агарозном геле свидетельствует о расщеплении ДНК случайным образом ("шмер") [39]. Данная система представляет большой интерес как очень наглядная модель ЗГК, с помощью которой можно попытаться выяснить многие вопросы природы и регуляции ЗГК у растений. Например, каким образом одна из соседствующих клеток гибнет, а другая продолжает функционировать? Чем определяется восприимчивость/нечувствительность к сигналам запуска ЗГК? Какова природа самих сигналов инициации программы ЗГК [8]?

НУКЛЕАЗЫ, УЧАСТВУЮЩИЕ В ЗГК ПРИ УВЯДАНИИ

Увядание - завершающая стадия жизненного цикла отдельных органов (листья, лепестки) или целых монокарпических растений. Этот процесс отличается сложной организацией и четкой скоординированностью изменений клеточной ультраструктуры и метаболизма. Его начало строго контролируется сигнальными каскадами, которые инициируют изменения в экспрессии генов и синтезе белков de novo. В основной массе это гидролитические ферменты, способные разрушать макромолекулы. Отличительной особенностью увядания, которая позволяет рассматривать этот процесс как отдельный тип ЗГК растений, является мобилизация углерода и азота в гибнущих клетках и их перенос к растущим частям организма, например, семенам и плодам. Увядание, прежде всего, контролируется возрастным фактором при условии оптимальных условий произрастания, и время его индукции видоспецифично. Однако на начало увядания влияют (а) различные внутренние и внешние сигналы, которые складываются в "информацию о возрасте", а также (б) неблагоприятные факторы внешней среды. Таким образом, увядание может рассматриваться как интегральный ответ клеток на "информацию о возрасте" и другие внутренние и внешние сигналы. Изучение механизмов реализации ЗГК при увядании представляет интерес с точки зрения единообразия и/или взаимодействия различных программ клеточной гибели, которыми, очевидно, располагает растение. Естественное и индуцированное увядание может представлять собой модель для изучения взаимодействия разных программ клеточной гибели, и самостоятельный интерес представляет выявление маркеров этих программ, которыми могут служить и гидролизующие нуклеиновые кислоты ферменты [41, 42].
Сведений относительно специфичности действия, функционирования и регуляции нуклеаз, участвующих в разрушении клеток при увядании (старении), немного. Число публикаций о нуклеазных активностях, ассоциированных с деградацией ДНК, характерной для завершающих стадий ЗГК при увядании, существенно превышает перечень работ, посвященных выделению индивидуальных ферментов.
Работы, в которых изучали нуклеазы, ассоциированные со старением листа, появились одними из первых среди сообщений о ферментативных системах, задействованных в реализации программы ЗГК у растений. Так, еще в 1971 г. из стареющих листьев овса был выделен фермент с РНКазной и ДНКазной активностью [42]. Отмечено заметное возрастание РНКазных и ДНКазной активностей в первом листе проростков кукурузы в процессе старения [43]. В цикле работ [44(46] в стареющих листьях пшеницы была выявлена нуклеазная активность, предпочтительно использующая в качестве субстрата одноцепочечные нуклеиновые кислоты (SSP-нуклеаза). Эта суммарная нуклеазная активность состоит из активностей трех ферментов (32, 35 и 38 кД), два из которых кроме РНКазной обладали еще и ДНКазной активностью. Эти ферменты ( Zn2+-зависимые эндонуклазы, активные при кислых значениях рН. Выявленная дифференциальная экспрессия этих SSP-нуклеаз при естественном и индуцированном темнотой увядании свидетельствовала об их непосредственном участии в этом процессе. В то же время, в листьях близкородственного злака - ячменя ( увядание листьев сопровождалось индукцией Са2+-зависимой нуклеазы, ингибируемой ионами Zn2+ [47]. В стареющем колеоптиле риса обнаружена сопровождающая этот процесс индукция двух Са2+/Mg2+-зависимых нуклеаз; обе нуклеазы ингибируются ионами Zn2+ и ЭДТА [48]. Апоптозоподобная (межнуклеосомная) фрагментация ДНК была обнаружена в стареющих листьях Eucommia ulmoides: деградация ДНК развивалась на фоне индукции и возрастания активности Са2+-зависимой нуклеазы c мол. м. около 20 кД [49].
Проводимые в нашей лаборатории работы дополняют перечисленные выше примеры сведениями о функционировании наборов нуклеаз при увядании листьев как у одно- так и двудольных растений. Мы установили, что деградация ДНК, сопровождающая увядание листьев гороха нормального (AfAf) и афильного (afaf) генотипов, коррелировала с увеличением суммарной нуклеазной активности. В листьях гороха были выявлены индуцирующиеся при старении Са2+/Мg2+-зависимые ДНКазы с мол. м. 42, 37, 34, 26 и 21 кД; причем на разных этапах старения листа набор ДНКаз в нем изменялся [50]. Также было показано, что по мере развития этиолированных проростков пшеницы ДНКазная активность в колеоптиле и апикальной части первого листа значительно увеличивалась, что совпадало с выраженной межнуклеосомной фрагментацией ДНК в этих органах. В листе и колеоптиле растений пшеницы выявлены как Са+2/Mg, так и Znзависимые нуклеазные активности (с мол. м. от 16 до 80 кД); причем, наблюдался дифференциальный характер изменения этих активностей в ходе старения и в листе, и в колеоптиле. Кроме того, выявлена субклеточная (ядро, цитоплазма) разнокачественность по составу и активности наборов ДНКаз, которые специфично изменялись по мере развития проростка и старения колеоптиля [51]. Довольно полно охарактеризованы два фермента, индуцирующиеся в стареющих листьях томатов LeNUC1 (41 кД) и LeNUC2 (39 кД). Эти нуклеазы специфичны для процесса увядания, поскольку в созревающих плодах они не обнаруживаются. Оба фермента LeNUC являются гликопротеинами, они имеют оптимум рН при 7.5(8.0, ингибируются ЭДТА, но ионы Со2+ и Mn2+ восстанавливают энзиматическую активность в присутствии хелатирующих агентов. Полагают, что LeNUC2 это негликозилированная форма LeNUC1 [52].
К настоящему времени из растений выделен и очищен лишь один фермент, обладающий эндонуклеазной активностью, экспрессия которого активируется параллельно развитию процесса увядания. Из стареющих колеоптилей пшеницы была выделена Ca2+/Mg2+-зависимая эндонуклеаза WEN1 с мол. м. 27 кД, отличающаяся термостабильностью и активностью в широком интервале значений рН (6.5(9.0) и с двумя максимами активности (при pH 6.5(7.5 и 9.0(10.5). Отличительными особенностями этой нуклеазы являются более эффективный гидролиз метилированной ДНК по сравнению с неметилированной, а также ее активация донором метильных групп S-аденозилметионином (SAM) [53]. Наряду с этим, из везикулярной фракции клеток стареющих, подверженных апоптозу колеоптилей 8-дневных этиолированных проростков пшеницы была выделена и охарактеризована еще одна эндонуклеаза (WEN2) с кажущейся мол. м. 21.5 кД [54]. Как и описанная ранее эндонуклеаза WEN1 того же происхождения, фермент WEN2 является нейтральной Ca2+/Mg2+/Mn2+-зависимой эндонуклеазой. Обе эти ферментативные активности найдены и в ядре претерпевающих ЗГК клеток колеоптиля. Mn2+ активизирует WEN2 гораздо эффективнее, чем Mg2+ и Ca2+. Высокая ионная сила, Zn2+ и ЭДТА полностью ингибируют фермент. В присутствии Mg2+ фермент WEN2 наиболее активен при pH от 5.5 до 7.7 и 37ºС, а без добавления Mg2+ в еще более узком интервале значений рН (от 6.8 до 7.7). WEN2 сохраняет активность при высокой температуре (65ºС). В отличие от WEN1 фермент WEN2 предпочтительно расщепляет неметилированную ДНК и в качестве субстрата предпочитает двухцепочечную ДНК. SAM значительно увеличивает активность эндонуклеазы WEN2 (оптимальная концентрация SAM 0.3 мM). В отличие от сильного стимулирующего действия на WEN1, конкурентные ингибиторы реакции метилирования ДНК (аналоги SAM) SAH и SiBA при концентрации 0.3 мM гораздо слабее стимулируют гидролиз неметилированной ДНК ферментом WEN2. Предполагается, что WEN2 участвует в апоптозной деградации ДНК [54].
Таким образом, у растений существуют эндонуклеазы, которые распознают субстратные ДНК по статусу метилирования и по-разному модулируются донором метильных групп - SAM и его аналогами. Это может указывать на существование у высших растений системы рестрикции(модификации генома (RM).
При инкубации в присутствии эндонуклеаз WEN1 и WEN2 ядер, выделенных из колеоптилей пшеницы, в них происходит выраженная межнуклеосомная фрагментация ДНК [54]. Именно в межнуклеосомных областях локализован гистон Н1, который, как известно, участвует в компактизации хроматина. Оказалось, что in vitro гистон Н1 модулирует действие этих нуклеаз [55]. Суммарный гистон Н1 из проростков пшеницы или печени крысы стимулирует гидролиз ДНК фага λ эндонуклеазами WEN1 и WEN2, выделенными из колеоптилей пшеницы. Оптимальное весовое соотношение ДНК(белок в реакции этого гидролиза 1 : 1. Действие полученных с помощью электрофореза фракций I и IV пшеничного гистона Н1 на гидролиз ДНК ферментами WEN1 и WEN2 зависит от статуса метилирования ДНК. Фракция IV гистона Н1 пшеницы усиливает гидролиз неметилированной ДНК фага λ ферментами WEN1 и WEN2. Гидролиз метилированной ДНК фага λ (она содержит 5-метилцитозин в Cm5CWGG последовательностях и N6-метиладенин в Gm6ATC сайтах) ферментом WEN1 ингибируется фракциями I и IV гистона Н1 пшеницы. Фракции II и III гистона Н1 на активность эндонуклеаз пшеницы не влияют. Как уже упоминалось, SAM модулирует активность растительных эндонуклеаз. Однако в присутствии Н1 гистона SAM не обладает дополнительной к действию гистона Н1 способностью усиливать гидролиз ДНК. Тем самым, модулирующее действие Н1 гистона и SAM на гидролиз ДНК в известной мере сходно. Возможно, SAM и гистон НI индуцируют аналогичные аллостерические превращения в структуре изученных растительных эндонуклеаз. Таким образом, гидролиз ДНК растительными эндонуклеазами модулируется как суммарным гистоном Н1, так и его фракциями. Отдельные фракции гистона Н1 пшеницы влияют на гидролиз ДНК по-разному; они стимулируют или, напротив, ингибируют гидролиз, в том числе и в зависимости от статуса метилирования ДНК [55]. Предполагается, что под влиянием гистона Н1 может изменяться сайтовая специфичность эндонуклеаз, либо в структуре ДНК возникают или исчезают дополнительные сайты, доступные для действия этих ферментов.
На фоне обширного и интенсивного развития генно-инженерных технологий работы по клонированию, секвенированию генов нуклеаз, связанных с программой ЗГК увядания у растений, представляются довольно скромными. Идентифицирован и охарактеризован ген BFN1 Arabidopsis thaliana, кодирующий нуклеазу (38 кД), гидролизующую как РНК, так и ДНК. Уровень экспрессии этого гена был невелик в молодых листьях, стеблях и корнях, и он резко возрастал в листьях и лепестках при увядании. Параллельно наблюдалось увеличение соответствующей нуклеазной активности. Рекомбинантная нуклеаза BFN1 отличалась явным предпочтением к ssДНК и оказалась Zn2+-зависимым ферментом [56]. На примере BFN1 была продемонстрирована тканеспецифическая экспрессия нуклеазы, ассоциированной с определенным типом ЗГК - увяданием: этот фермент не обнаруживался в различных органах при прорастании семян и у взрослых растений в условиях фосфорного голодания, но индуцировался при увядании листьев.
Межнуклеосомная фрагментация ДНК является характерным маркером увядания видоизмененных листьев - лепестков и прилистников цветка. Деградация ДНК в ходе увядания наблюдалась в лепестках цветков гороха [57], лепестках Alstroemeria peruviensis [58], венчике табака, являющегося классической моделью ЗГК при увядании лепестков, где детально изучена динамика изменений целостности ДНК и выявлена апоптозоподобная деградация ДНК на завершающих стадиях увядания [59].
На завершающих стадиях увядания лепестков петунии резко увеличивается олигонуклеосомная фрагментация ДНК при одновременном возрастании нуклеазной активности [60]. В суммарном белковом экстракте из увядающих лепестков было выявлено пять нуклеаз с мол. м. от 28 до 50 кД. Эти нуклеазы оказались Са2+/Mg2+-зависимыми, они имели оптимум активности при нейтральных значениях рН и гидролизовали как ssДНК, так и dsДНК, причем, активность всех пяти ферментов увеличивалась в процессе старения. В увядающих лепестках Petunia ( hybrida обнаружено семь различных по молекулярной массе пептидов, обладающих нуклеазными активностями, которые возрастали в процессе увядания [61]. Из трансгенных растений с дефектом в синтезе этилена (35S:etr1-1) была выделена и очищена до гомогенности одна из упомянутых выше нуклеаз ( PhNUC1 (43 кД). PhNUC1 гидролизует ДНК и РНК при нейтральных значениях рН, ингибируется ЭДТА и активируется ионами Со2+. Показано, что PhNUC1 локализована в ядре и в молодых лепестках индуцируется этиленом.
Увядание лепестков краснодрева рыжего (Hemerocallis hybrid, сорт Stella d'Oro) ( процесс достаточно быстрый и строго организованный [62]. В отсутствие видимых признаков увядания в клетках лепестков лилейника отмечалось увеличение числа ядер с фрагментированной ДНК (TUNEL+) и возрастание, по крайней мере, трех нуклеазных активностей, предпочтительно гидролизующих ssДНК. Причем индукция нуклеаз стимулируется АБК и тормозится циклогексимидом.
В 14-дневных увядающих лепестках тюльпана обнаружена ассоциированная с межнуклеосомной фрагментацией ДНК Са2+/Mg2+-зависимая ДНКаза (30 кД), ингибируемая 1 мМ ЭДТА [63].
В ядрах клеток лепестков Antirrhinum, Argyranthemum, Petunia и Ipomoea при увядании наблюдалась деградация ДНК, причем она происходила еще до появления видимых признаков увядания (утраты тургора) [64(66]. В ходе увядания увеличивалось число "ядерных масс", что свидетельствует о дроблении ядра, причем доказано, что ядерные массы окружены мембраной. Это явление аналогично образованию апоптозных телец в животных клетках. К сожалению, сами нуклеазные активности, участвующие в процессах деструкции ядра в клетках лепестков, не изучены. Суспензионные культуры растительных клеток предоставляют широкие возможности для изучения индукции и механизмов реализации процесса ЗГК. Однако работ, связанных с изучением механизмов деградации ДНК, и в частности, нуклеазных активностей, участвующих в этом процессе, крайне мало. Они ограничиваются в основном выявлением TUNEL-позитивных клеток и электрофоретическим анализом выделенной ДНК, т.е. носят вспомогательные маркерные функции. Такие работы проводили на суспензионной культуре клеток арабидопсиса [67, 68], табака [69, 70], яблони [71], рапса [72] и хлопчатника [73]. Хотя этот список может быть продолжен, динамика изменения нуклеазной активности, ассоциированной с клеточной гибелью in vitro (старением культуры), исследована лишь в гетеротрофной суспензионной культуре клеток риса [74]. Обнаруженная нуклеазная активность, предпочтительно гидролизующая однотяжевые ДНК, оказалась неоднородной (26 и 53.5 кД) и неизвестно, являются ли эти пептиды моно- или димерной формами одной и той же нуклеазы. Свойства этих ферментов практически идентичны - оптимум их активности наблюдался при рН 5.5, они зависели от ионов Zn2+ (10 мМ) и ингибировались ЭДТА (10 мМ). В культуре клеток тисса остроконечного индукция ЗГК Se4+ была связана с заметным возрастанием нуклеазных активностей с мол. м. 34, 22 и 20 кД соответственно. Все эти нуклеазные активности имели оптимум в нейтральной области рН и стимулировались ионами Са2+ и Mg2+. Ингибитор каспаз Ac-DEVD-CHO не влиял на активность 34 кД нуклеазы, но ингибировал нуклеазы с мол. м. 22 и 20 кД. Кроме того, показано, что ингибирование накопления активных форм кислорода значительно снижало активность всех трех нуклеаз [75].

НУКЛЕАЗЫ, УЧАСТВУЮЩИЕ В ЗГК ПРИ ФОРМИРОВАНИИ АДАПТИВНОГО ОТВЕТА

Устойчивость растений к факторам внешней среды биотической и абиотической природы определяется целым набором адаптивных реакций, среди которых в последние годы особое место отводится ЗГК. Изоляция внедрившегося в ткани растения патогена, удаление поврежденных клеток при механическом или химическом воздействии, образование аэренхимы в условиях гипоксии ( все эти события сопряжены с определенным типом ЗГК. Действие стрессовых факторов на границе порога устойчивости клетки требует быстрой защитной реакции и включения такой программы гибели клеток хозяина, которая обеспечивает минимальные потери и быструю ликвидацию последствий стресса. В этой связи, индуцированные внешними факторами программы ЗГК, очевидно, должны отличаться от довольно протяженных во времени программ ЗГК при увядании и некоторых типов ЗГК развития. Какие клеточные компартменты участвуют в ЗГК при адаптивном ответе, какие ферментативные системы активируются в первую очередь, осуществляется ли их синтез de novo, и привлекаются ли предсуществующие ферменты? Все эти вопросы могут быть адресованы и к нуклеолитическому комплексу растительной клетки [13].

Биотический стресс и гиперчувствительный ответ

Гиперчувствительный ответ (ГЧО) ( это защитная реакция растения на внедрение патогена (грибы, бактерии, вирусы и другие), которая носит комплексный характер и в том числе включает обособление патогена слоем погибших клеток. Гибель обреченных клеток представляет собой одну из форм ЗГК, в наибольшей степени функционально сходную с апоптозом животных клеток [13]. Впервые подробный анализ нуклеазных активностей, индуцирующихся при ЗГК во время ГЧО, был проведен с использованием тканей листьев табака, инфицированных вирусом TMV [76]. Была обнаружена индукция трех Са2+-зависимых нуклеазных активностей c мол. м. 100.5 кД (NUCI), 38 кД (NUCII) и 36 кД (NUCIII), которые ингибируются ЭДТА, ЭГТА и ионами Zn2+. Одна из этих нуклеаз (NUCIII), присутствовавшая в ядрах клеток пораженных ВТМ листьев, была выделена и очищена до гомогенного состояния. Термостабильность этой нуклеазы была использована в качестве одного из этапов очистки фермента. Аффинное связывание ее конконавалином А указывало на ее гликозилированную природу; очищенный белок имел мол. м. 34.5 кД. NUCIII гидролизовала гетерологичную денатурированную ДНК из молок лосося и двухцепочечную плазмидную ДНК, а также гомологичную ДНК из клеток табака. Деградация кольцевой суперскрученной плазмидной ДНК ферментом NUCIII осуществлялась поэтапно: сначала происходило никирование одной из цепей плазмидной ДНК и ее релаксация, и вслед за этим гидролизовалась и другая нить ДНК, следствием чего являлась линеаризация плазмидной ДНК. Позднее [77] была предложена более детальная схема деградации ДНК во время ЗГК, связанной с ГЧО: на начальных этапах ЗГК вслед за оттоком электролитов из гибнущей клетки в ее ядре происходило расщепление ДНК на фрагменты длиной до 50 т.п.н., что инициировало конденсацию хроматина и последующую фрагментацию ДНК. Кроме того, в апопластной фракции инфицированных тканей также была обнаружена высокая ДНКазная активность, обусловленная в основном двумя нуклеазами ( индуцируемой ЗГК и конститутивной. Последняя была обозначена как NUC35; она оказалась близка TC NUC, секретируемой в среду культивирования клетками суспензионной культуры табака (антитела к NUC35 взаимодействовали с ТС NUC). В свою очередь, ТС NUC, скорее всего, идентична нуклеазе I, которая была ранее выделена из культуральной жидкости культуры клеток табака [78] и охарактеризована как Zn2+-зависимая нуклеаза с оптимумом в кислой области значений рН. Считается, что окончательный гидролиз фрагментов ДНК происходит в апоплaсте с участием нуклеаз типа NUC35 [76].
Обработка викторином (вырабатываемый грибом Cochliobolus victoriae токсин) индуцирует в клетках листьев овса ЗГК, которая по морфологическим показателям аналогична ЗГК при гиперчувствительном ответе. Викторин индуцирует эндонуклеазу р28 (28 кД), и ее появление предшествует фрагментации ДНК, причем эта нуклеаза дает четкую "апоптозную лестницу" фрагментов гидролиза ДНК [79]. С помощью определения нуклеазных активностей in gel (рН 6.5) в клеточных экстрактах овса были выявлены еще одна индуцируемая нуклеаза р24 (24 кД) и четыре конститутивные - р22, р31, р33, р35. Все эти нуклеазы сохраняли активность при 60ºС, а нуклеазы р31 и р33 были активны даже при температурах до 80оС. Неожиданными оказались свойства этих нуклеазных активностей: в отличие от других нуклеаз растений, участвующих в ЗГК, эти нуклеазы не ингибировались хелатирующими агентами (ЭДТА, ЭГТА) и не нуждались в ионах двухвалентных металлов Са2+, Mg2+ и Zn2+. Считается, что по совокупности свойств эти нуклеазы могут быть отнесены к семейству ДНКазы II. Однако, в то время как апоптозные нуклеазы животных могут самостоятельно вызывать конденсацию хроматина и фрагментацию ДНК, нуклеаза овса способна гидролизовать ДНК только в присутствии Е-64-чувствительной цистеиновой протеазы. Протеазные активности, возможно, принимают участие в протеолизе гистонов, ламинов и актина, что облегчает доступность субстрата для нуклеаз [80]. Это аналогично сведениям о том, что при индукции апоптоза в культуре лимфоцитов деградация хроматина успешна только в присутствии сериновой протеазы, а ингибирование фермента запрещало расщепление ламина И1 и разрушение хроматина [81].

Абиотический стресс

ГЧО можно рассматривать как адаптивную реакцию растения на биотический стресс, тогда как стрессовые воздействия различных абиотических факторов внешней среды также могут вызывать адаптивные реакции у растений в форме ЗГК.
Так, в листьях растений ячменя в условиях засоления происходит индукция ЗГК, сопровождающаяся фрагментацией ДНК и индукцией нуклеазной активности Bnuc1. Ген, кодирующий Bnuc1, клонирован и секвенирован; по нуклеотидной последовательности он гомологичен BEN1 - гену нуклеазы, секретируемой клетками алейронового слоя в прорастающих семенах ячменя. В ответ на солевой стресс и АБК в листьях ячменя содержание Bnuc1 мРНК резко увеличивалось и параллельно возрастала нуклеазная активность, причем ответ на солевой стресс в старых листьях был выражен гораздо сильнее, чем в молодых [82]. В клетках кончиков корней риса при повышении содержания NaCl в среде культивирования наблюдались типичные для ЗГК растений изменения в структуре ядра. Межнуклеосомную фрагментацию яДНК при этом связывают с индуцируемыми активностями двух эндонуклеаз ( цитоплазматической (OsCyt20, 20 кД) и ядерной (OsNuc37, 37 кД); обе нуклеазы индуцировались через 2 ч и достигали максимальной активности через 4 ч после внесения в среду NaCl. OsCyt20 - нейтральная Са2+/Mg2+-зависимая нуклеаза, а OsNuc37 - гликопротеин с рН оптимумом в кислой области (рН 4.5(6.0), Zn2+-зависимая нуклеаза, осуществляющая деградацию яДНК [83].
В ответ на затопление в результате ЗГК в корнях наблюдается формирование лизогенной аэренхимы. Сравнение морфологических изменений, происходящих в клетках корней кукурузы при образовании аэренхимы, с изменениями, происходящими в апоптозной клетке животных, свидетельствуют об их апоптозоподобном характере этого процесса [84]. Генетически контролируемая форма ответа на затопление подтверждается тем, что образование аэренхимы в гипокотилях арабидопсиса определяется балансом активностей регуляторов защитной реакции растений ( LSD1, EDS1 и PAD4 [85]. Причем этот процесс тканеспецифчен. Однако сведения об экспрессии гидролитических ферментов, участвующих в клеточной гибели, в том числе и нуклеаз, практически отсутствуют. К настоящему времени представлены лишь свидетельства сопряженной TUNEL-позитивной реакции [86] и апоптозоподобной деградации ДНК [87] при формировании аэренхимы в корнях кукурузы и гороха. В колеоптилях риса найдено несколько нуклеаз, действие которых связано с формированием аэренхимы [88].
ЗГК может запускаться в растительных клетках (суспензионная культура клеток табака BY-2) снижением температуры выращивания с 27 до 5(6ºС. Ранние стадии ЗГК при этом характеризуются конденсацией хроматина и гидролизом ДНК на протяженные фрагменты длиной 50(100 т.п.н., а позднее (через 2 нед.) появляется характерная "лесенка" олигонуклеосомальных фрагментов ДНК [89].
Озон является стрессовым фактором для растений; вызываемые им нарушения приводят к быстрому увяданию поврежденных листьев. Полагают, что озон является индуктором ЗГК. После воздействия озона отмечается индукция активности группы РНКаз и разных нуклеаз в листьях пшеницы. При определении нуклеазной активности в экстрактах тканей листьев пшеницы, находившихся в атмосфере озона, выявлено значительное усиление активности нескольких предсуществовавших РНКаз и ДНКаз (39 и 34 кД) [90]. Эти сведения могут быть полезны для анализа функций различных нуклеаз, присутствующих в растительной клетке, и выявления нуклеаз, специфичных для различных программ ЗГК.

НУКЛЕАЗЫ ОРГАНЕЛЛ

Клеточные органеллы принимают самое активное участие в ЗГК. В содержащих хлоропласты органах растений запуск программы ЗГК начинается снижением фотосинтетической активности в хлоропластах при одновременных деградации хлорофилла, изменениях морфологии субклеточных структур и гидролизе хлоропластной ДНК [91]. В деградации хлоропластной ДНК участвует фермент с эндонуклеазной активностью, специфичной к структуре субстрата [92]. Митохондрии определяют энергетическое обеспечение процесса ЗГК, и кроме того, в межмембранном пространстве митохондрий находится эндонуклеаза G (EndoG), осуществляющая межнуклеосомную фрагментацию ядерной ДНК при апоптозе в случае инактивации системы CAD/ICAD [93, 94]. В межмебранном пространстве митохондрий арабидопсиса найдены две разные эндонуклеолитические активности. Результатом работы одной эндонуклеазы является гидролиз ДНК до фрагментов длиной 30 т.п.н. (через 3 ч) и конденсация хроматина через 6 ч после обработки интактных ядер митохондриями. В результате работы второй эндонуклеазы происходит олигосомальная фрагментация ДНК через 12 ч инкубации ядер с митохондриями и она нуждается в присутствии цитозольного экстракта. Кроме того, в межмембранном пространстве митохондрий выявлена Mg2+-зависимая нуклеаза [95]. Косвенное доказательство участия митохондриальной эндонуклеазы в деградации ДНК при ЗГК было продемонстрировано на листьях конопли. Каннабиноиды (каннабихроминиковая и тетрагидроканнабиноликовая кислоты), накапливающиеся в головчатых железах растения, индуцируют гибель клеток листа. Эти вторичные метаболиты повреждают митохондрии (открываются МРТ поры без участия Са2+ и других цитозольных факторов, падает митохондриальный трансмембранный потенциал), при этом происходит выброс цитохрома с и нуклеаз(ы), вызывающих(ей) деградацию ядерной ДНК, причем каспазные ингибиторы не влияют на этот процесс [96].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В таблице суммированы перечисленные сведения о растительных нуклеазах, участвующих в деградации ДНК при ЗГК.
Подавляющее большинство изученных к настоящему времени растительных эндонуклеаз являются бифункциональными эндонуклеазами, сочетающими свойства РНКаз и ДНКаз. Бифункциональные нуклеазы - ферменты, относящиеся к группе нуклеазы I или S1 нуклеазы (КФ 3.1.30.2). Отличительной особенностью нуклеаз этого семейства является предпочтительное использование в качестве субстрата одноцепочечных нуклеиновых кислот. К этой группе относятся внеклеточные термостабильные гликопротеины, гидролизующие РНК и ssДНК эндонуклеолитически. Они предпочтительно расщепляют связи вблизи остатков аденина с образованием 5'-фосфорилированных олиго- и мононуклеотидов. На присоединении содержащего флуоресцентную метку дезокси-УМФ к свободным 3'-ОН c помощью терминальной дезоксирибонуклеотидилтрансферазы основан широко используемый метод - TUNEL, позволяющий выявлять ники и разрывы в ДНК на клеточном уровне in situ [98]. Эти ферменты имеют мол. м. в интервале 31(42 кД; они чувствительны к ЭДТА и нуждаются в Zn2+ для активации и стабилизации структуры, а их оптимум рН находится в кислой области [99, 100]. Наиболее изученными представителями этих нуклеаз являются нуклеаза Р1 из Penicillum citrum и нуклеаза S1 из Aspergillus niger. В качестве яркого примера растительных нуклеаз этого класса может служить нуклеаза А, выделенная из 5-дневных этиолированных проростков житняка и очищенная до гомогенного состояния [97]. Всесторонний анализ свойств этого фермента позволяет составить более полное представление о растительных нуклеазах этой группы. Нуклеаза А ( мономер с мол. м. 36 кД. Его ферментативная активность не нуждается в ионах двухвалентных металлов, но стимулируется ионами Zn2+. Эффективным ингибитором нуклеазы А является спермин, и ее активность умеренно подавляется NaСl, при рI = 4.7 оптимум рН составляет 5.5. Сульфгидрильные реагенты не ингибируют нуклеазу А; следовательно, в ней отсутствуют существенные для активности дисульфидные мостики. Нуклеиновые кислоты нуклеаза А гидролизует в порядке предпочтения ssДНК > dsДНК > РНК, а синтетические гомополирибонуклеотиды ( polyU ( polyI ( polyA ( polyG ( polyC. Нуклеаза А никирует плазмидную ДНК и не гидролизует динуклеозидмонофосфаты. Что касается специфичности нуклеазы А к межнуклеотидным связям в олигонуклеотиде 5'-Р32-ССТGGСАGТТ, то наиболее предпочтительной является связь в АрТ и затем в порядке убывания в рТ, СрТ и GрG, а связь в СрС не гидролизуется нуклеазой А. Продуктами реакции, катализируемой нуклеазой А, являются олигонуклеотиды с фосфатом в 3'-положении. Физиологическая функция нуклеазы А житняка неизвестна. Она выделена из молодых неповрежденных проростков, в клетках которых программы ЗГК находятся в латентном состоянии. Однако этиоляция может рассматриваться как стрессовое состояние, и функционирование нуклеазы А может быть связано с формированием адаптивного ответа растения на темноту.
Среди нуклеаз, участвующих в деградации ДНК при ЗГК у растений, обнаружены ферменты, отличающиеся по своим свойствам от типичных ферментов группы нуклеазы 1. Это нейтральные нуклеазы с потребностью в ионах Са2+, Mg2+, Co2+ и Mn2+, сходные с главными ДНКазами апоптоза у животных ( CAD и EndoG. Предложенное разделение растительных нуклеаз, участвующих в деградации ДНК при ЗГК, на две группы - Zn2+- и Са2+-зависимые, достаточно условно и механистично [6]. Существует мнение о необходимости обособления третьей группы нуклеаз, вовлеченных в программу клеточной гибели - Со2+-зависимые [61]. Кроме того, предлагается основные группы рассматриваемых нуклеаз разделить на подгруппы в зависимости от их специфичности гидролиза пар нуклеотидов в одной и той же синтетической последовательности дезоксирибонуклеотидов [100]. Более четкая классификация этих нуклеаз будет составлена лишь после определения нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих эти ферменты. Однако пока эти сведения ограничены лишь очень кратким списком: гены BEN1 и ZEN1 [30], Bnuc1 [82], DSA6 [101], Bnuc2 [12], BFN1, ZEN2 и ZEN3 [56], CEL I [102], StEN1 [103].
Список нуклеаз, участвующих в деградации ДНК при ЗГК растений (таблица, [6]), достаточно внушителен, и все же он далек от завершения. Чем можно объяснить такое разнообразие и множественность нуклеазных активностей, гидролизующих ДНК при ЗГК? Этот вопрос тут же влечет за собой следующий - насколько существенны различия в механизмах деструкции растительной клетки при различных типах ЗГК (апоптозоподобной, аутофаговой и некрозоподобной)? Сам факт существования, по крайней мере, трех морфологических типов ЗГК у растений [15] и различия в их транскриптомных профилях [104, 105] указывают на объективную возможность существования видо- и органоспецифичности программ ЗГК у растений. Так, уже сейчас можно говорить о характерном для вида растения наборе нуклеаз, участвующих в деградации ДНК при старении листьев. На это указывает отсутствие полного совпадения набора нуклеазных активностей, гидролизующих ДНК в колеоптиле риса [88], листьях ячменя [27], орхидеи [49], житняка [97], гороха и пшеницы [50, 51]. Выявленная многокомпонентность и разнообразие нуклеазных пулов, обнаруживаемых при деструкции ДНК, может определяться, прежде всего, изменяющейся во времени доступностью субстрата и его поэтапным гидролизом - гидролиз ДНК на фрагменты 50(300 т.п.н. (олигосомальная фрагментация) и случайное (неспецифическое) эндо- и экзонуклеолитическое расщепление. Однако в зависимости от формы ЗГК, органа растения или интенсивности стресса к этому процессу могут привлекаться или исключаться из него те или иные нуклеазные активности. Эта сложность не является уникальной для ферментативного обеспечения метаболизма нуклеиновых кислот. Так, нуклеазы, участвующие в метаболизме РНК здоровых клеток, образуют экзосому, содержащую 11 различных 3'-5'-экзонуклеаз, а процесс апоптозной деградации хромосомной ДНК у С. elegans осуществляет группа из 10 взаимодействующих между собой нуклеаз, пять из которых формируют так называемую "деградосому" [106]. Аналогично в клетках Saccharomyces cerevisiae в апоптозной деградации ДНК участвуют, по крайней мере, 8 ферментов, гомологичных основным апоптозным нуклеазам С. elegans [107]. Последние примеры заслуживают особого внимания, поскольку в комплекс апоптозных нуклеаз у С. elegans и дрожжей входят гомологи нуклеаз человека, которые участвуют в процессинге РНК, сборке белков, репликации и репарации ДНК [108]. Не исключено, что и у растений в определенных программах ЗГК задействованы и предсуществующие конститутивные нуклеазы, необходимые для жизнедеятельности клетки. Вполне возможно, что "3 R" нуклеазы - репликации, репарации, рекомбинации ( могут участвовать в уничтожении того, что ими было создано и охранялось. Так, из черенков листьев сельдерея выделена CEL I нуклеаза, специфичная к "mismatch" нуклеотидным заменам, участвующая в репаративных процессах и принадлежащая к семейству S1 нуклеазы [109]. Получены рекомбинантные формы CEL I и его гомолога из шпината SP I [110]. Филогенетическое родство CEL I и SP I с эндонуклеазами ZEN1, BFN1 и DSA6, определяющими деградацию ДНК при ЗГК, позволяет предположить и возможную мобилизацию CEL I и SP I для решения задач ЗГК. Из генома риса клонированы две нуклеазы (OsFEN-1a, OsFEN-1b), гомологичные семейству RAD2/FEN-1, для членов которого характерна специфичность к структуре ДНК и участие в репликации и репарации [111]. При iРНК-инактивации еще одного гена OsGEN-L нуклеазы риса семейства RAD2/XPG происходят нарушения в развитии микроспор [112], когда, как отмечалось ранее, в некоторых тканях пыльников включается программа ЗГК.
Для решения многих вопросов эволюции ферментативных систем, обеспечивающих реализацию генетических программ клеточной гибели у различных групп организмов, важно иметь как можно более полную информацию о компонентах этих систем. При сравнении ЗГК животных и растений самым интригующим фактом является то, что механизмы этих процессов и некоторые индуцирующие факторы функционально консервативны, в то время как структурная гомология на молекулярном уровне, примером которой могут служить каспазы и каспазоподобные белки [113], EndoG и ее растительные аналоги [96], отсутствует. В то же время, структурные изменения хроматина и ядра при ЗГК у растений и животных во многом аналогичны, даже на стадии фрагментации ядра. Фрагментация ядер с образованием "ядерных масс" отмечалась при старении лепестков цветов [64, 65]. Надо иметь в виду, что "стратегии" клеточной гибели могут по-разному зависеть от особенностей организации клетки и организма в целом у растений и животных [114]. Доступные в настоящее время данные о растительных нуклеазах, завершающих деструкцию ДНК в ходе того или иного типа ЗГК, позволяют лишь определить некие тенденции и аналогии в реализации предетерминированной деградации ДНК. Систем, идентичных CAD/ICAD, до настоящего времени у растений не обнаружено, как и не выявлены гены, гомологичные гену EndoG.
Итак, многие растительные эндонуклеазы ДНК как главные нуклеазы при апоптозе являются нейтральными Са2+/Mg2+-зависимыми нуклеазами, гидролизующими как двух- и одноцепочечные ДНК, так и РНК. Они могут распознавать статус метилирования субстратных ДНК и в зависимости от сочетанного действия ионов металлов и SAM по-разному расщепляют эти ДНК. Следует особо отметить, что при атаке на ДНК в хроматине активности этих ферментов по-разному модулируются гистоном Н1.
Работа была частично поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (грант № 05-04-48071) и Программой Президента России "Ведущие научные школы" (НШ-3444.2008.4).

 

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1.Kerr J.F.R., Wyllie A.H., Currie A.R. Apoptosis: A Basic Biological Phenomenon with Wide-Raging Implications in Tissue Kinetics // Br. J. Cancer. 1972. V. 26. P. 239-257.
2.Wyllie A.H. Glucocorticoid-Induced Thymocyte Apoptosis Is Associated with Endogenous Endonuclease Activation // Nature. 1980. V. 284. P. 555-556.
3.Williamson R. Properties of Rapidly Labelled Deoxyribonucleic Acid Fragments Isolated from the Cytoplasm of Primary Cultures of Embryonic Mouse Liver Cells // J. Mol. Biol. 1970. V. 51. P. 157-168.
4.Widlak G.P., Garrard W.T. Discovery, Regulation, and Action of the Major Apoptotic Nucleases DFF40/CAD and Endonuclease // J. Cell Biochem. 2005. V. 94. P. 1078-1087.
5.Samejima K., Earnshaw W.C. Trashing the Genome: The Role of Nucleases during Apoptosis // Mol. Cell Biol. 2005. V. 6. P. 677-688.
6.Sugiyama M., Ito J., Aoyagi S., Fukuda H. Endonucleases // Plant Mol. Biol. 2000. V. 44. P. 387-397.
7.Rogers H.J. Cell Death and Organ Development in Plants // Curr. Top. Dev. Biol. 2005. V. 71. P. 225-261.
8.Gunawardena A.H. Programmed Cell Death and Tissue Remodeling in Plants // J. Exp. Bot. 2008. V. 59. P. 445-451.
9.Papini A., Mosti S., Brighigna L. Programmed-Cell Death Events during Tapetum Development of Angiosperms // Protoplasma. 1999. V. 207. P. 213-221.
10.Vischi M., Marchetti S. Strong Extracellular Nuclease Activity Displayed by Barley (Hordeum vulgare L.) Uninucleate Microspores // Theor. Appl. Genet. 1997. V. 95. P. 185-190.
11.Marchetti S., Zaina G., Chiaba C., Pappalardo C., Pitotti A. Isolation and Characterization of an Endonuclease Synthesized by Barley (Hordeum vulgare L.) Uninucliate Microspores // Planta. 2001. V. 213. P. 199-206.
12.Zaina G., Morassutti C., de Amicis F., Fogher C., Marchetti S. Endonuclease Genes Up-Regulated in Tissues Undergoing Programmed Cell Death Are Expressed during Mail Gametogenesis in Barley // Gene. 2003. V. 15. P. 43-50.
13.Coimbra S., Torrão L., Abreu I. Programmed Cell Death Induces Male Sterility in Actinidia deliciosa Female Flowers // Plant Physiol. Biochem. 2004. V. 42. P. 537-541.
14.Schwartz B.W., Vernon D.A., Meinke D.W. Development of the Suspensor: Differentiation, Communication and Programmed Cell Death during Plant Embryogenesis // Cellular and Molecular Biology of Plant Seed Development / Ed. Vasil B. Dordrecht: Kluwer, 1997. P. 53-72.
15.Van Doorn W.G., Woltering E.J. Many Ways to Exit? Cell Death Categories in Plant // Trends Plant Sci. 2005. V. 10. P. 117-122.
16.Lombardi L., Ceccarelli N., Picciarelli P., Lorenzi R. DNA Degradation during Programmed Cell Death in Phaseolus coccineus Suspensor // Plant Physiol. Biochem. 2007. V. 45. P. 221-227.
17.Lombardi L., Ceccarelli N., Picciarelli P., Lorenzi R. Caspase-Like Proteases Involvement in Programmed Cell Death of Phaseolus coccineus Suspensor // Plant Sci. 2007. V. 172. P. 573-578.
18.Dominguez F., Moreno J., Cejudo F.J. The Nucellus Degeneration by a Process of Programmed Cell Death during the Early Stages of Wheat Grain Development // Planta. 2001. V. 213. P. 352-360.
19.Greenwood J.S., Helm M., Gietl C. Ricinosomes and Endosperm Transfer Cell Structure in Programmed Cell Death of the Nucellus during Ricinus Seed Development // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. V. 102. P. 2238-2243.
20.Lombardi L., Casani S., Ceccarelli N., Galleschi L., Picciarelli P., Lorenzi R. Programmed Cell Death of the Nucellus during Seed Development Is Associated with Activation of Caspase-Like Proteases // J. Exp. Bot. 2007. V. 58. P. 2949-2958.
21.Dominguez F., Cejudo F.J. Identification of a Nuclear-Localized Nuclease from Wheat Cells Undergoing Programmed Cell Death That Is Able to Trigger DNA Fragmentation and Apoptotic Morphology on Nuclei from Human Cells // Biochem. J. 2006. V. 397. P. 529-536.
22.Crawford B.C., Ditta G., Yanofsky M.F. The NTT Gene Is Required for Transmitting-Tract Development in Carpels of Arabidopsis thaliana // Curr. Biol. 2007. V. 17. P. 1101-1108.
23.Bosch M., Franklin-Tong V.E. Self-Incompatibility in Papaver: Signalling to Trigger PCD in Incompatible Pollen // J. Exp. Bot. 2008. V. 59. P. 481-490.
24.Young T.E., Gallie D.R. Programmed Cell Death during Endosperm Development // Plant Mol. Biol. 2000. V. 44. P. 283-301.
25.Li R., Lan S.Y., Xu Z.X. Programmed Cell Death in Wheat during Starchy Endosperm Development // Zhi Wu Sheng Li Yu Fen Zi Sheng Wu Xue Xue Bao. 2004. V. 30. P. 183-188.
26.Lan S.Y., Zhong F.X., Yang Z.M., Jin D.M., Xu Z.X. The Starchy Endosperm Denucleation by a Process of Programmed Cell Death during Rice Grain Development // Shi Yan Sheng Wu Xue Bao. 2004. V. 37. P. 34-44.
27.Fath A., Bethke P., Lonsdale J., Meza-Romero R., Jones R. Programmed Cell Death in Cereal Aleurone // Plant Mol. Biol. 2000. V. 44. P. 255-266.
28.Young T.E., Callie D.R., de Mason D.A. Ethylene-Mediated Programmed Cell Death during Maize Endosperm Development of Wild-Type and srunken2 Genotypes // Plant Physiol. 1997. V. 115. P. 737-751.
29.Brown P.H., Ho T.H. Biochemical Properties and Hormonal Regulation of Barley Nuclease // Eur. J. Biochem. 1987. V. 168. P. 357-364.
30.Aoyagi S., Sugiyama M., Fukuda H. BEN1 and ZEN1 cDNAs Encoding S1-Type DNases That Are Associated with Programmed Cell Death in Plants // FEBS Lett. 1998. V. 429. P. 134-138.
31.Fath A., Bethke P.C., Jones R.L. Barley Aleurone Cell Death Is Not Apoptotic: Characterization of Nuclease Activities and DNA Degradation // Plant J. 1999. V. 20. P. 305-315.
32.Wang M., Oppedijk B.J., Caspers M.P.M., Lamers G.E.M., Boot M.J., Geerlings D.N.G., Bakhuizen B., Meijer A.H., van Duijn B. Spatial and Temporal Regulation of DNA Fragmentation in the Aleurone of Germinating Barley // J. Exp. Bot. 1998. V. 49. P. 1293-1301.
33.Dominguez F., Moreno J., Cejudo F.J. A Gibberellin-Induced Nuclease Is Localized in the Nucleus of Wheat Aleurone Cell Undergoing Programmed Cell Death // J. Biol. Chem. 2004. V. 19. P. 11 530-11 536.
34.He X., Kermode A.R. Nuclease Activities and DNA Fragmentation during Programmed Cell Death of Megagametophyte Cell of White Spruce (Picea glauca) Seeds // Plant Mol. Biol. 2003. V. 51. P. 509-521.
35.Fukuda H. Programmed Cell Death during Vascular System Formation // Cell Death Diff. 1997. V. 4. P. 684-688.
36.Turner S., Gallois P., Brown D. Tracheary Element Differentiation // Annu. Rev. Plant Biol. 2007. V. 58. P. 407-433.
37.Thelen M.P., Northcote D.H. Identification and Purification of a Nuclease from Zinnia elegans L.: A Potential Molecular Marker for Xylogenesis // Planta. 1989. V. 179. P. 181-195.
38.Ito J., Fukuda H. ZEN1 Is a Key Enzyme in the Degradation of Nuclear DNA during Programmed Cell Death of Tracheary Elements // Plant Cell. 2002. V. 14. P. 3201-3211.
39.Gunawardena A.H., Sault K., Donnelly P., Greenwood J.S., Dengler N.G. Programmed Cell Death and Leaf Morphogenesis in Monstera obliqua (Araceae) // Planta. 2005. V. 221. P. 607-618.
40.Lim P.O., Kim H.J., Nam H.G. Leaf Senescence // Annu. Rev. Plant Biol. 2007. V. 58. P. 115-136.
41.Hopkins M., Taylor C., Lin Z., Ma F., McNamara L., Wang T.-W., Thompson J.S. Regulation and Execution of Molecular Disassembly and Catabolism during Senescence // New Phytol. 2007. V. 175. P. 201-214.
42.Wyen N.V., Erdei S., Farkas G.L. Isolation from Avena Leaf Tissues of a Nuclease with the Same Type of Specificity towards RNA and DNA. Accumulation of the Enzyme during Leaf Senescence // Biochim. Biophys. Acta. 1971. V. 232. P. 472-483.
43.BeMiller J.N., Liu T.U.Y.S., Liu C.R., Pappelis A.J. Relationship of Nuclease Activity and Synthesis to Senescence of Corn (Zea mays L.) Stalk Pith, Cob Parenchyma and First Developed Leaf Tissues // Mech. Ageing Dev. 1976. V. 5. P. 427-436.
44.Blank A., McKeon T.A. Single-Strand-Preferring Nuclease Activity in Wheat Leaves Is Increased in Senescence and Is Negatively Photoregulated // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. V. 86. P. 3169-3173.
45.Blank A., McKeon T.A. Expression of Three RNases during Natural and Dark-Induced Senescence of Wheat Leaves // Plant Physiol. 1991. V. 97. P. 1409-1413.
46.Blank A., McKeon T.A. Three RNases in Senescent and Nonsenescent Wheat Leaves // Plant Physiol. 1991. V. 97. P. 1402-1408.
47.Wood M., Power J.B., Davey M.R., Lowe K.C., Mulligan B.J. Factors Affecting Single Strand-Preferring Nuclease Activity during Leaf Aging and Dark-Induced Senescence in Barley (Hordeum vulgare L.) // Plant Sci. 1998. V. 131. P. 149-159.
48.Kawai M., Uchimiya Y. Coleoptile Senescence in Rice (Oryza sativa L.) // Ann. Bot. 2000. V. 86. P. 405-414.
49.Cao J., Jiang F., Sodmergen, Cui K. Time-Course of Programmed Cell Death during Leaf Senescence in Eucommia ulmoides // J. Plant Res. 2003. V. 116. P. 7-12.
50.Александрушкина Н.И., Коф Э.М., Середина А.В., Борзов А.А., Ванюшин Б.Ф. Связанные со старением деградация ДНК и эндонуклеазные активности в листьях гороха нормального и афильного генотипов // Физиология растений. 2008. Т. 55 С. 27-36.
51.Александрушкина Н.И., Середина А.В., Ванюшин Б.Ф. Эндонуклеазные активности в колеоптиле и листе этиолированных проростков пшеницы // Физиология растений. 2009. Т. 56. С.
52.Lers А., Lomaniec E., Burd S., Khalchitski A. The Characterization of LeNUC1, a Nuclease Associated with Leaf Senescence of Tomato // Physiol. Plant. 2001. V. 112. P. 176-182.
53.Fedoreyeva L.I., Sobolev D.E., Vanyushin B.F. Wheat Endonuclease WEN1 Dependent on S-Adenosyl-L-Methionine and Sensitive to DNA Methylation Status // Epigenetics. 2007. V. 2. P. 50-53.
54.Федореева Л.И., Соболев Д.Е., Ванюшин Б.Ф. S-аденозил-L-метионинзависимая и чувствительная к статусу метилирования ДНК эндонуклеаза WEN2 из колеоптилей пшеницы // Биохимия. 2008.Т. 73. С. 1243-1251.
55.Федореева Л.И., Смирнова Т.А., Коломийцева Г.Я., Ванюшин Б.Ф. Гистон Н1 модулирует гидролиз ДНК эндонуклеазами WEN1 и WEN2 из колеоптилей пшеницы // Биохимия. 2008. Т. 73. С.
56.Perez-Amador M.A., Abler M.L., de Rocher E.J., Thompson D.M., van Hoof A., LeBrasseur N.D., Lers A., Green P.J. Identification of BFN1, a Bifuctional Nuclease Induced during Leaf and Stem Senescence in Arabidopsis // Plant Physiol. 2000. V. 122. P. 169-180.
57.Orzaez D., Granell A. DNA Fragmentation is Regulated by Ethylene during Petal Senescence in Pisum sativum // Plant J. 1997. V. 11. P. 137-144.
58.Wagstaff C., Malcolm P., Rafiq A., Leverentz M., Griffiths G., Thomas B., Stead A., Rogers H. Programmed Cell Death (PCD) Processes Begin Extremely Early in Alstroemeria Petal Senescence // New Phytol. 2003. V. 160. P. 49-59.
59.Serafini-Fracassini D., del Duca S., Monti F., Poli F., Sacchetti G., Bregoli A.M., Biondi S., Della Mea M. Transglutaminase Activity during Senescence and Programmed Cell Death in the Corolla of Tobacco (Nicotiana tabacum) Flowers // Cell Death Diff. 2002. V. 9. P. 309-321.
60.Xu Y., Hanson M.R. Programmed Cell Death during Pollination Induced Petal Senescence in Petunia // Plant Physiol. 2000. V. 122. P. 1323-1333.
61.Langston B.J., Bai S., Jones M.L. Increases in DNA Fragmentation and Induction of a Senescence-Specific Nuclease Are Delayed during Corolla Senescence in Ethylene-Insensitive (etr1-1) Transgenic Petunias // J. Exp. Bot. 2005. V. 56. P. 15-23.
62.Panavas T., le Vangie R., Mistler J., Reid P.D., Rubinstein B. Activities of Nucleases in Senescing Daylily Petals // Plant Physiol. Biochem. 2000. V. 38. P. 837-843.
63.Azad K., Ishikawa T., Ishikawa T., Sawa Y., Shibata H. Intracellular Energy Depletion Triggers Programmed Cell Death during Petal Senescence in Tulip // J. Exp. Bot. 2008. V. 59. P. 2085-2095.
64.Yamada T., Ichimura K., van Doorn W.G. DNA Degradation and Nuclear Degeneration during Programmed Cell Death in Petals of Antirrhinum, Argyranthemum, and Petunia // J. Exp. Bot. 2006. V. 57. P. 3543-3552.
65.Yamada T., Takatsu Y., Kasumi M., Ichimura K., van Doorn W.G. Nuclear Fragmentation and DNA Degradation during Programmed Cell Death in Petals of Morning Glory (Ipomoea nil) // Planta. 2006. V. 224. P. 1279-1290.
66.Yamada T., Ichimura K., van Doorn W.G. Relationship between Petal Abscission and Programmed Cell Death in Prunus yedoensis and Delphinium belladonna // Planta. 2007. V. 226. P. 1195-1205.
67.McCabe P.F., Leaver C.J. Programmed Cell Death in Cell Cultures // Plant Mol. Biol. 2000. V. 44. P. 359-368.
68.Reape T.J., Molony E.M., McCabe P.F. Programmed Cell Death in Plants: Distinguishing between Different Modes // J. Exp. Bot. 2008. V. 59. P. 435-444.
69.Houot V., Etienne P., Petitot A.-S., Barbier S., Blein J.-P., Suty L. Hydrogen Peroxide Induces Programmed Cell Death Features in Cultured Tobacco BY-2 Cells, in a Dose-Dependent Manner // J. Exp. Bot. 2001. V. 52. P. 1721-1730.
70.De Pinto M.С., Paradiso A., Leonetti P., de Gara L. Hydrogen Peroxide, Nitric Oxide and Cytosolic Ascorbate Peroxidase at the Crossroad between Defence and Cell Death // Plant J. 2006. V. 48. P. 784-795.
71.Xu C.J., Chen K.S., Ferguson I.B. Programmed Cell Death Features in Apple Suspension Cells under Low Oxygen Culture // J. Zhejiang. Univ. Sci. 2004. V. 5. P. 137-143.
72.Singh V.K., Wood S.M., Knowles V.L., Plaxton W.C. Phosphate Accelerates Programmed Cell Death in Phosphate-Starved Oilseed Rape (Brassica napus) Suspension Cell Cultures // Planta. 2003. V. 218. P. 233-239.
73.Xia Q.Z., Zhang X.L., Nie Y.C., Guo X.P., Zhu L.F. Spontaneous and Induced Programmed Cell Death in Suspension Cell Cultures of Cotton (Gossypium hirsutum L.) // Shi Yan Sheng Wu Xue Bao. 2005. V. 38. P. 303-308.
74.Hosseini R., Mulligan B.J. Application of Rice (Oryza sativa L.) Suspension Culture in Studying Senescence In Vitro. I. Single Strand Preferring Nuclease Activity // Electron. J. Biotechnol. 2007. V. 5. P. 43-54.
75.Ge Z.Q., Yang S., Yuan Y.J. Ce(4+) Induced Down-Regulation of ERK-Like MARK and Activation of Nucleases during the Apoptosis of Cultured Taxus cuspidate Cells // J. Inorg. Biochem. 2006. V. 100. P. 167-177.
76.Mittler R., Lam E. Identification, Characterization, and Purification of a Tobacco Endonuclease Activity Induced upon Hypersensitive Response Cell Death // Plant Cell. 1995. V. 7. P. 1951-1962.
77.Mittler R., Simon L., Lam E. Pathogen-Induced Programmed Cell Death in Tobacco // J. Cell Sci. 1997. V. 110. P. 1333-1344.
78.Oleson A.E., Janski A.M., Clark E.T. An Extracellular Nuclease from Suspension Cultures of Tobacco // Biochim. Biophys. Acta. 1974. V. 366. P. 89-100.
79.Tada Y., Hata S., Takata Y., Nakayashiki H., Tosa Y., Mayama S. Induction and Signaling of an Apoptotic Response Typified by DNA Laddering in the Defense Response of Oats to Infection and Elicitors // Mol. Plant Microbe Interact. 2001. V. 14. P. 477-486.
80.Kusaka K., Tada Y., Shigemi T., Sakamoto M., Nakayashiki H., Tosa Y., Mayama S. Coordinate Involvement of Cysteine Protease and Nuclease in the Executive Phase of Plant Apoptosis // FEBS Lett. 2004. V. 578. P. 363-367.
81.Zhivotovski B., Gahm A., Orrenius S. Two Different Proteases Are Involved in the Proteolysis of Lamin during Apoptosis // Biochem. Biophys. Res. Comm. 1997. V. 233. P. 96-101.
82.Muramoto Y., Watanabe A., Takabe N.T. Enhanced Expression of a Nuclease Gene in Leaves of Barley Plants under Salt Stress // Gene. 1999. V. 234. P. 315-321.
83.Jiang A.L., Cheng Y., Li J., Zhang W. A Zinc-Dependent Nuclear Endonuclease Is Responsible for DNA Laddering during Salt-Induced Programmed Cell Death in Root Tip Cells of Rice // J. Plant Physiol. 2008. V. 165. P. 1134-1141.
84.Evans D.E. Aerenchyma Formation // New Phytol. 2004. V. 161. P. 35-49.
85.Muhlenbock P., Plaszczyca M., Plaszczyca M., Mellerowicz E., Karpinskia S. Lysigenous Aerenchyma Formation in Arabidopsis Is Controlled by LESION SIMULATING DISEASE1 // Plant Cell. 2007. V. 19. P. 3819-3830.
86.Gunawardena A.H.L.A.N., Pearce D.M., Jackson M.B., Hawes C.R., Evans D.E. Characterization of Programmed Cell Death during Aerenchyma Formation Induced by Ethylene or Hypoxia in Roots of Maize (Zea mays L.) // Planta. 2001. V. 212. P. 205-214.
87.Gladish D.K., Xu J., Niki T. Apoptosis-Like Programmed Cell Death Occurs in Procambium and Ground Meristem of Pea (Pisum sativum) Root Tips Exposed to Sudden Flooding // Ann. Bot. 2006. V. 97. P. 895-902.
88.Inada N., Sakai A., Kuroiwa H., Kuroiwa T. Three-Dimensional Progression of Programmed Cell Death in Rice Coleoptile // Int. Rev. Cytol. 2002. V. 218. P. 221-258.
89.Koukalova B., Kovarik A., Fajkus J., Siroky J. Chromatin Fragmentation Associated with Apoptotic Changes in Tobacco Cells Exposed to Cold Stress // FEBS Lett. 1997. V. 414. P. 289-292.
90.Booker L.F. Influence of Ozone on Ribonuclease Activity in Wheat (Triticum aestivum) Leaves // Physiol. Plant. 2004. V. 120. P. 249-255.
91. Shaver J.M., Oldenburg D.J., Bendich A.J. Changes in Chloroplast DNA during Development in Tobacco, Medicago truncatula, Pea, and Maize // Planta. 2006. V. 224. P. 72-82.
92.Przykorska A., Solecka K., Olszak K., Keith G., Nawrot B., Kuligowska E. Wheat (Triticum vulgare) Chloroplast Nuclease ChSI Exhibits 5' Flap Structure-Specific Endonuclease Activity // Biochemistry. 2004. V. 43. P. 11 283-11 294.
93.Li L., Luo X., Wang X. Endonuclease G Is an Apoptotic DNase When Released from Mitochondria // Nature. 2001. V. 412. P. 95-99.
94.Parrish J., Li L., Klotz K., Ledwich D., Wang X., Xue D. Mitochondrial Endonuclease G Is Important for Apoptosis in C. elegans // Nature. 2001. V. 412. P. 90-94.
95.Balk J., Chew S.K., Leaver C.J., McCabe P.F. The Intermembrane Space of Plant Mitochondria Contains a DNase Activity That May Be Involved in Programmed Cell Death // Plant J. 2003. V. 34. P. 573-583.
96. Morimoto S., Tanaka Y., Sasaki K., Tanaka H., Fukamizu T., Shoyama Y., Shoyama Y., Taura F. Identification and Characterization of Cannabinoids That Induce Cell Death through Mitochondrial Permeability Transition in Cannabis Leaf Cells // J. Biol. Chem. 2007. V. 282. P. 20 739-20 751.
97.Yursanis T., Symeonidis L., Kalemi T., Moustaka H., Yupsani A. Purification, Properties and Specificity of an Endonuclease from Agropyron elongatum Seedling // Plant Physiol. Biochem. 2004. V. 42. P. 795-802.
98.Gavrieli Y., Sherman Y., Ben-Sasson S.A. Identification of Programmed Cell Death In Situ via Specific Labeling of Nuclear DNA Fragmentation // J. Cell Biol. 1992. V. 119. P. 493-501.
99.Fraser M.J., Low R.L. Fungal and Mitochondrial Nucleases // Nucleases / Eds Linn S.M., Lloyd R.S., Roberts R.J. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Lab., 1993. P. 171-207.
100.Desai N.A., Shankar V. Single-Strand-Specific Nucleases // FEMS Microbiol. Rev. 2003. V. 26. P. 457-491.
101.Panavas T., Pikula A., Reid P.D., Rubinstein B., Walker E.L. Identification of Senescence-Associated Genes from Daylily Petals // Plant Mol. Biol. 1999. V. 40. P. 237-248.
102.Yang B., Wen X., Kodali N.S., Oleykowski C.A., Miller C.G., Kulinski J., Besack D., Yeung J.A., Kowalski D., Yeung A.T. Purification, Cloning, and Characterization of the CEL I Nuclease // Biochemistry. 2000. V. 39. P. 3533-3541.
103.Larsen K. Molecular Cloning and Characterization of a cDNA Encoding Endonuclease from Potato (Solanum tuberosum) // J. Plant Physiol. 2005. V. 162. P. 1263-1269.
104.Van der Graaff E., Schwacke R., Schneider A., Desimone M., Flügge U.I., Kunze R. Transcription Analysis of Arabidopsis Membrane Transporters and Hormone Pathways during Developmental and Induced Leaf Senescence // Plant Physiol. 2006. V. 141. P. 776-792.
105.Gregersen P.L., Holm P.B. Transcriptome Analysis of Senescence in the Flag Leaf of Wheat (Triticum aestivum L.) // Plant Biotechnol. J. 2007. V. 5. P. 192-206.
106.Samejima V., Earnshaw W.C. Trashing the Genome: The Role of Nucleases during Apoptosis // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2005. V. 6. P. 677-688.
107.Qiu J., Yoon J.H., Shen B. Search for Apoptotic Nucleases in Yeast: Role of Tat-D Nuclease in Apoptotic DNA Degradation // J. Biol. Chem. 2005. V. 280. P. 15 370-15 379.
108.Parrish J.Z., Xue D. Functional Genomic Analysis of Apoptotic DNA Degradation in C. elegans // Mol. Cell. 2003. V. 11. P. 987-996.
109.Yang B., Wen X., Kodali N.S., Oleykowski C.A., Miller C.G., Kulinski J., Besack D., Yeung J.A., Kowalski D., Yeung A.T. Purification, Cloning, and Characterization of the CEL I Nuclease // Biochemistry. 2000. V. 39. P. 3533-3541.
110.Pimkin M., Caretti E., Canutescu A., Yeung J.B., Cohn H., Chen Y., Oleykowski C., Bellacosa A., Yeung A.T. Recombinant Nucleases CEL I from Celery and SP I from Spinach for Mutation Detection // BMC Biotechnol. 2007. V. 1. P. 7-29.
111.Kimura S., Furukawa T., Kasai N., Mori Y., Kitamoto H.K., Sugawara F., Hashimoto J., Sakaguchi K. Functional Characterization of Two Flap Endonuclease-1 Homologues in Rice // Gene. 2003. V. 314. P. 63-71.
112.Moritoh S., Miki D., Akiyama M., Kawahara M., Izawa T., Maki H., Shimamoto K. RNA-Mediated Silencing of OsGEN-L (OsGEN-like), a New Member of the RAD2/XPG Nuclease Family, Causes Male Sterility by Defect of Microspore Development in Rice // Plant Cell Physiol. 2005. V. 46. P. 699-715.
113.Bonneau L., Ge Y., Drury G.E., Gallois P. What Happened to Plant Caspases? // J. Exp. Bot. 2008. V. 59. P. 491-499.
114.Della Mea M., Serafini-Fracassini D., Del Duca S. Programmed Cell Death: Similarities and Differences in Animals and Plants. A Flower Paradigm // Amino Acids. 2007. V. 33. P. 395-404.