УДК 581.1
ВЫДЕЛЕНИЕ ВЫСОКОКАЧЕСТВЕННОЙ РНК ИЗ РАЗЛИЧНЫХ ТКАНЕЙ Populus
© 2009 г. М. Су, В. Цзан, Н. Яо, М. Хуан
Центральная лаборатория генетики и генной инженерии лесных растений Наньцзинского университета леса, Наньцзин, КНР
Поступила в редакцию 26.02.2008 г.
Populus обладает всеми качествами модельного древесного растения для функционально-генетических исследований, поскольку имеет небольшой размер генома, быстро растет, сравнительно легок при работе в экспериментальных условиях и при генетических исследованиях. Выделение высококачественной РНК из тканей Populus, богатых полифенолами и полисахаридами, часто весьма затруднительно. Вторичные метаболиты не только уменьшают выход, но и делают выделяемую РНК непригодной для дальнейшей работы. В данной работе описывается модификация процедуры выделения РНК из различных тканей Populus, включая корни, зеленые стебли, листья и почки. Главным новшеством метода стали дополнительная экстракция ДДС и осаждение этанолом после очистки цетилтриметиламмонийбромидом(LiCl. Следуя методу, авторы получали РНК, которая потом могла быть использована для последующих молекулярных исследований. Качество РНК оценивалось методом гель-электрофореза и спектрофотометрически (А260/А230 и А260/А280) Отношение А260/А230 было выше 2.0, а отношение А260/А280 было между 1.9 и 2.0. Полученную РНК с успехом использовали для проведения ПЦР, быстрой амплификации концов кДНК и создания библиотек супрессионной вычитающей гибридизации.
Ключевые слова: Populus - выделение РНК - ОТ(ПЦР - SSH-библиотеки.
-----------------------------------
[A1]Сокращения: ДЭПК - диэтилпирокарбонат; ПВП - поливинилпирролидон; ЦТАБ - цетилтриметиламмонийбромид; SSH - супрессионная вычитающая гибридизация.
[A2]Адрес для корреспонденции: Minren Huang. The Key National Laboratory of Forest Genetics and Gene Engineering, Nanjing Forestry University, Nanjing, 210037 China. Fax: 86-25-8542-74-12; e-mail: mengxu412@126.com; mrhuang@njfu.edu.cn


ВВЕДЕНИЕ

Современная биотехнология играет важную роль в молекулярных исследованиях, используемых в сельском хозяйстве. Такие исследования нуждаются в эффективном методе получения больших количеств качественной РНК. Однако выделение РНК из древесных растений затруднительно из-за высокого содержания фенолов, полисахаридов, и эндогенных РНКаз. Фенолы легко окисляются до ковалентно-связанных хининов и легко связывают нуклеиновые кислоты [1]. Загрязнение полисахаридами затрудняет растворение осажденной РНК, искажает определение концентрации спектрофотометрическим методом и может нарушать ферментативные реакции, проводимые в дальнейшем, выделение полиА+РНК и проведение электрофореза [2]. Эндогенные рибонуклеазы также могут значительно снизить выход РНК. Кроме того, у растений при стрессе, например инфекционном, существенно повышается накопление вторичных метаболитов [3]. Чтобы избежать описанных негативных явлений, разработано несколько способов выделения РНК; однако только некоторые из них дают удовлетворительные результаты с Populus (таблица). Поскольку авторы занимались изучением молекулярной биологии Populus, в частности, развития придаточных корней у поросли, покоя почек и формирования древесины, был необходим простой и эффективный метод, позволяющий не только выделять качественную РНК из различных тканей на разных этапах развития Populus, но и получать хороший выход продукта без потери РНК слабо или редко экспрессирующихся генов. В статье приводится метод Chang с использованием цетилтриметиламмонийбромида (ЦТАБ) [9], модифицированный добавлением стадий обработки ДДС и осаждения этанолом. Описываемый метод - оптимизированная процедура, позволяющая эффективно выделять РНК высокого качества из целого ряда тканей и органов Populus на разных стадиях развития, а также при действии стресса. Полученная РНК была пригодна для молекулярных исследований, проводимых в дальнейшем.

МЕТОДИКА

Растительный материал. Верхушечные почки Populus adenopoda Maxim. собирали в полевых условиях в сентябре и ноябре. Ткани Populus euramericana отбирали в теплице на различных стадиях развития корней на черенках. Ткань разрезали, быстро замораживали жидким азотом и хранили при (70(С. Все виды Populus и типы их ткани приведены в таблице.
Реактивы. Все использованные растворы и реагенты готовили на Milliq-воде, обработанной диэтилпирокарбонатом (ДЕПК, "Millipore"). Использовали следующие реактивы: (а) экстракционный ЦТАБ-буфер: 100 мМ Трис(HCl (рН 8.0); 25 мМ ЭДТА; 2 М NaCl; 2% ЦТАБ и 2% поливинилпирролидон (ПВП). 2% 2-меркаптоэтанол добавляли в смесь перед использованием; (б) хлороформ : изоамиловый спирт (24 : 1); (в) экстракционный ДДС-буфер: 1 М NaCl; 0.5% ДДС; 10 мМ Трис(HCl (рН 8.0); 1 мМ ЭДТА; (г) 70% этанол; (д) абсолютный этанол; (е) Milliq-вода, автоклавированная и обработанная ДЕПК ("Millipore").
Все пластиковые материалы обрабатывали ДЕПК и автоклавировали. Стеклянную посуду, а также ступки и пестики выдерживали 3(6 ч при 180(С.
Протокол выделения РНК:
1) предварительно подогреть ЦТАБ-буфер в 50-миллилитровых пробирках типа Falcon до 65оC;
2) 0.8-1.5 г замороженной ткани растереть в ступке с жидким азотом, избегать оттаивания ткани;
3) перенести растертый материал в пробирку типа Falcon;
4) инкубировать суспензию при 65(С 10(15 мин с интенсивным перемешиванием каждые 2 мин;
5) добавить один объем (15 мл) смеси хлороформа и изоамилового спирта, встряхнуть и осаждать при 6000 g 20 мин при 4(С;
6) перенести полученную верхнюю фазу жидкости в новую пробирку и повторить операцию (5);
7) отделить верхнюю фазу жидкости и добавить в нее 0.25 объема 10 М LiCl. Осаждать в течение ночи при 4(С;
8) центрифугировать смесь при 10 000 g и 4(С 30 мин. Предварительно подогреть ДДС-буфер до 60(С;
9) удалить супернатант, ресуспендировать осадок в 600 мкл теплого ДДС буфера, перенести суспензию в пробирку объемом 1.5 мл и добавить 600 мкл хлороформ(изоамиловой смеси. Раствор встряхнуть и осадить в течение 10 мин при 4(С и 9200 g;
10) перенести верхнюю фазу жидкости в новую пробирку с 600 мкл хлороформ(изоамиловой смеси и повторить центрифугирование;
11) перенести супернатант в пробирку объемом 1.5 мл, добавить два объема охлажденного абсолютного этанола и осаждать РНК при (70(С 2(3 ч;
12) осадить РНК при 15500 g при 4(С в течение 30 мин и дважды промыть осадок 1 мл охлажденного 70% этанола с центрифугированием при 9200 g при 4(С 2 мин;
13) осадок высушить под вакуумом и растворить в необходимом объеме автоклавированной Milliq-воды, обработанной ДЕПК (100 мкл/г исходного материала). Хранить РНК при (70(С;
14) очищенную РНК исследовать на наличие рРНК методом гель-электрофореза в 1% агарозе с окраской бромистым этидием;
15) определять оптическое поглощение препарата РНК при длинах волн 230, 260, 280 и 320 нм на спектрофотометре Beckman Coulter DU 800.
ПЦР в реальном времени. Концентрацию, выход и качество РНК оценивали по оптическому поглощению 10 мкл раствора при 230, 260 и 280 нм. С помощью спектрофотометрии и электрофореза препарата РНК, полученного описываемым методом, не было выявлено присутствия ДНК. Перед проведением ПЦР в реальном времени или RACE-ПЦР препарат РНК обрабатывали ДНКазой I ("Invitrogen"). RACE-ПЦР для выбранного гена проводили с помощью FirstChoice RLM-RACE Kit ("Ambion"). Длина продуктов амплификации соответствовала ожидаемой для исследованного гена, что подтверждалось секвенированием. Для количественной оценки экспрессии гена в различных тканях Populus (корнях, стеблях и листьях) проводили ПРЦ в реальном времени на ABI 7500 Real-Time PCR Systems ("Applied Biosystems"). Матричную кДНК получали обратной транскрипцией 1 мкг выделенной РНК с помощью системы Superscript для ОТ-ПЦР ("Invitrogen"). 20 мкл реакционной среды содержали 3 мкл продукта обратной транскрипции (разбавление 1 : 5). Каждая реакция выполнялась в трех повторностях, в качестве внутреннего контроля использовали ген фактора инициации трансляции. Получение количественных данных об относительных изменениях в экспрессии гена проводили с использованием формулы 2-ΔΔCT, как описано у Livak и Schmittgen [10].
Дополнительно проводили исследование генов, связанных с покоем у деревьев, физиологическим состоянием, позволяющим древесным растениям переживать неблагоприятные условия. РНК, выделенную из спящих верхушечных почек, с успехом использовали для создания SSH-библиотек (SSH ( супрессионная вычитающая гибридизация) и выявления генов, связанных с состоянием покоя.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Древесные растения Populus обладают уникальными свойствами для изучения клеточных и молекулярных механизмов. В соответствии с сезонно-климатическими циклами рост и развитие этих растений определяют процессы запасания и перераспределения метаболитов, что усложняет процесс качественного выделения РНК из ряда тканей и органов на разных стадиях развития и при действии стресса. Следовательно, необходима оптимизация методики выделения РНК для каждого вида растения и его ткани. В наших предыдущих экспериментах используемые стандартные методики и наборы для выделения РНК не обеспечивали одновременно достаточного качества и высокого выхода продукта из разных органов и тканей. Даже простейшие модификации оказывались более эффективными, чем все используемые раньше подходы.
Для успешного выделения интактной РНК из растительной ткани, богатой полисахаридами и полифенолами, весьма важно предотвращение связывания этих веществ с нуклеиновыми кислотами. Загрязняющие вещества могут со-осаждаться с РНК в процессе выделения и влиять на качество и выход продукта [11, 12]. Кроме того, выделение нуклеиновых кислот может затрудняться полифенолами и пектинами клеточной стенки, которые в большом количестве содержатся в древесных растениях. Для предотвращения окисления полифенолов и образования их высокомолекулярных комплексов с нуклеиновыми кислотами и белками использовали высокие концентрации ПВП и 2-меркаптоэтанола [13]. Высокие концентрации ЦТАБ и хлорида натрия использовали для сохранения целостности мембран ядра и органелл, для получения РНК с низким содержанием гетерогенной ядерной мРНК, продуктов транскрипции, не прошедших сплайсинг, и для повышения отношения РНК/ДНК [14, 15]. Единственным недостатком использования детергентов было присутствие их в препарате РНК, что повышало его оптическое поглощение при 260 нм [16]. Высокая концентрация ионов натрия в экстракционном буфере повышала растворимость полисахаридов, что препятствовало их совместному осаждению с РНК на последующих этапах выделения [17, 18]. Затем препараты РНК освобождали от ДНК осаждением в присутствии LiCl. Высокая концентрация LiCl не только избирательно осаждала РНК, но и способствовала осаждению длинных продуктов транскрипции отдельно от коротких [19]. И, наконец, экстракция с ДДС и осаждение этанолом, включенные в процедуру выделения после осаждения LiCl, обеспечивали необходимую очистку препарата от различных загрязнителей и остатков Li+.
Проведение электрофореза полученной РНК в 1% агарозном геле и визуализация полос бромистым этидием выявило отчетливые разделение 28S и 18S рРНК, что свидетельствовало о хорошем качестве препарата общей РНК (рис. 1). Отношение А260/А230 показывает уровень загрязнения пробы полисахаридами или полифенолами, а отношение А260/А280 служит индикатором загрязнения образца белками [11]. Нами были неоднократно получены значения А260/А230 выше 2 и А260/А280 - 1.9(2.0 (таблица), что говорит об отсутствии загрязнения препаратов полисахаридами, полифенолами и белками. Кроме того, качество препаратов РНК проверяли с помощью гель-электрофореза (рис. 1), возможностью проведения ПЦР в реальном времени, RACE-ПЦР и создания SSH-библиотеки.
Препараты общей РНК с успехом использовали для проведения RACE-ПЦР с геном RHD (ген дефектности корневых волосков) (рис. 2). На рис. 2 показан результат ПЦР с геноспецифичными праймерами. С помощью набора FirstChoice RLM-RACE Kit мы клонировали полноразмерные кДНК указанного гена. С использованием ПЦР в реальном времени был получен профиль его экспрессии в корнях, стеблях и листьях (рис. 3). Качество выделенной РНК также подтверждалось созданием SSH-библиотеки. Поскольку с эндонуклеазой (RsaI) кДНК реагировала полностью, SSH-библиотека получалась высокого качества. Таким образом, РНК, полученная по предлагаемой методике, полностью пригодна для проведения молекулярных исследований, а описываемый метод - простой, эффективный и надежный способ выделения РНК из различных тканей Populus.
Работа поддержана Китайским национальным фондом природных исследований (гранты № 30230300 и № 30671705).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1.Loomis W.D. Overcoming Problems of Phenolics and Quinones in the Isolation of Plant Enzymes and Organelles // Methods Enzymol. 1974. V. 31. P. 528-545.
2.Wilkins T.A., Smart L.W. Isolation of RNA from Plant Tissue // A Laboratory Guide to RNA: Isolation, Analysis and Synthesis / Ed. Krieg P.A. New York: Wile-Liss, 1996. P. 21-42.
3.Winkel-Shirley B. Biosynthesis of Flavonoids and Effects of Stress // Curr. Opin. Plant Biol. 2002. V. 5. P. 218-223.
4.Salzman R.A., Fujita T., Zhu-Salzman K., Hasegawa P.M., Bressan R.A. An Improved RNA Isolation Method for Plant Tissues Containing High Levels of Phenolic Compounds or Carbohydrates // Plant Mol. Biol. Rep. 1999. V. 17. P. 11-19.
5.Wan C.Y., Wilkins T.A. A Modified Hot Borate Method Significantly Enhances the Yield of High-Quality RNA from Cotton (Gossypium hirsutum L.) // Anal. Biochem. 1994. V. 223. P. 7-12.
6.Malnoy M., Reynoird J.P., Mourgues F., Chevreau E., Simoneau P. A Method for Isolating Total RNA from Pear Leaves // Plant Mol. Biol. Rep. 2001. V. 19. P. 69a-69f.
7.Azevedo H., Lino-Neto T., Tavares R.M. An Improved Method for High-Quality RNA Isolation from Needled of Adult Maritime Pine Trees // Plant Mol. Biol. Rep. 2003. V. 21. P. 333-338.
8.Xu Q., Wen X.P., Tao N.G., Hu Z.Y., Yue H.L., Deng X.X. Extraction of High Quality of RNA and Construction of a Suppression Subtractive Hybridization (SSH) Library from Chestnut Rose (Rosa roxburghii Tratt) // Biotechnol. Lett. 2006. V. 28. P. 587-591.
9.Chang S., Puryear J., Cairney J. A Simple and Efficient Method for Isolating RNA from Pine Trees // Plant Mol. Biol. Rep. 1993. V. 11. P. 113-116.
10.Livak K.J., Schmittgen T.D. Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2-ΔΔCT Method // Methods. 2001. V. 25. P. 402-408.
11.Logemann J., Schell J., Willmitzer L. Improved Method for the Isolation of RNA from Plant Tissues // Anal. Biochem. 1987. V. 163. P. 16-20.
12.McNeil M., Darvill A.G., Fry S.C., Albersheim P. Structure and Function of the Primary Cell Walls of Plants // Annu. Rev. Biochem. 1984. V. 53. P. 625-663.
13.Wang C.S., Vodkin L.O. Extraction of RNA from Tissues Containing High Levels of Procyanidins That Bind RNA // Plant Mol. Biol. Rep. 1994. V. 12. P. 132-145.
14.Mejjad M., Vedel F., Ducreux G. Improvement of DNA Preparation and of PCR Cycling in RAPD Analysis of Marine Microalgae // Plant Mol. Biol. Rep. 1994. V. 12. P. 6-13.
15.Dellaporta S.L., Wood J., Hicks J.B. A Plant DNA Minipreparation: Version II // Plant Mol. Biol. Rep. 1983. V. 1. P. 19-21.
16.Doyle J.J., Doyle J.L. Isolation of Plant DNA from Fresh Tissue // Focus. 1990. V. 12. P. 13-15.
17.Fang G., Hammar S., Rebecca R. A Quick and Inexpensive Method for Removing Polysaccharides from Plant Genomic DNA // Biotechniques. 1992. V. 13. P. 52-56.
18.Lodhi M.A., Ye G-N., Weeden N.F., Reisch B.I. A Simple and Efficient Method for DNA Extraction from Grapevine Cultivars and Vitis Species // Plant Mol. Biol. Rep. 1994. V. 12. P. 6-13.
19.Iandolino A.B., Goes da Silva F., Lim H., Choi H., Williams L.E., Cook D.R. High-Quality RNA, cDNA, and Derived EST Libraries from Grapevine (Vitis vinifera L.) // Plant Mol. Biol. Rep. 2004. V. 22. P. 269-278.


ПОДПИСИ К РИСУНКАМ

Рис. 1. Электрофорез общей РНК, выделенной из разных тканей Populus.
Слева направо: появляющиеся корни (1); первичные корни (2); зеленые стебли (3); листья (4); верхушечные почки (сентябрь) (5); верхушечные почки (ноябрь) (6).

Рис. 2. Электрофорез продуктов ПЦР в реальном времени, полученных для гена RHD из Populus euramericana.

Рис. 3. Профиль экспрессии RHD гена для разных тканей.
1 ( появляющиеся корни; 2 ( первичные корни; 3 ( зеленые стебли; 4 ( листья.