ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1
ВЛИЯНИЕ ИОНОВ Са2+ И цАМФ НА ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ БЕЛКОВ В
МИТОХОНДРИЯХ ПРОРОСТКОВ КУКУРУЗЫ
© 2009 г. И. Ю. Субота*, А. Ш. Арзиев*, Л. П. Сенженко*, В. И. Тарасенко*,
Г. А. Невинский**, Ю. М. Константинов*
* Сибирский институт физиологии и биохимии растений Сибирского отделения Российской
академии наук, Иркутск
** Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения
Российской академии наук, Новосибирск
Поступила в редакцию 16.07.2008 г.

В работе исследовано влияние широко распространенных внутриклеточных сигналов Ca2+ и
цАМФ на активность фосфорилирования белков в митохондриях колеоптелей кукурузы (Zea
mays L.). Обработка изолированных митохондрий 2 мМ CaCl2 приводила к увеличению
уровня фосфорилирования белков с мол. м. 74, 60 и 33 кД, но значительно снижала
фосфорилирование белка с мол. м. 51.5 кД. В присутствии ионов Са2+ дополнительно
выявлялось фосфорилирование полипептидов с мол. м. 59 и 66 кД. Под влиянием цАМФ
отмечено снижение фосфорилирования практически всех исследованных белков в
изолированных митохондриях, что, возможно, объясняется активацией их
дефосфорилирования. В фосфорилировании митохондриальных белков участвует
проявляющий киназную активность полипептид размером около 94 кД, который может быть
собственно протеинкиназой или одной из субъединиц мультимерного комплекса.
Обнаружено, что в митохондриях кукурузы присутствуют PP1A фосфатазы. Выдвинута
гипотеза о том, что редокс-зависимое фосфорилирование/дефосфорилирование
митохондриальных белков играет важную роль в митохондриальном сигналинге у высших
растений.
------------------------------------
Cокращения: БТШ – белки теплового шока; БХ – буфер для хроматографии; MnСOД – Mn-
содержащая супероксиддисмутаза; ФМСФ – фенилметилсульфонилфторид; MPT –
митохондриальная мегапроницаемость (от mitochondrial permeability transition).
Адрес для корреспонденции: Субота Ирина Юрьевна. 664033 Иркутск, а/я 317. Сибирский
институт физиологии и биохимии растений СО РАН. Факс: 007 (3952) 51-07-54; электронная
почта: subota@sifibr.irk.ru


Ключевые слова: Zea mays – митохондрии – Ca2+ – цАМФ – протеинкиназы –
протеинфосфатазы.

ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время общепризнано рассматривать обратимое фосфорилирование
клеточных белков в качестве важного механизма, который связывает внутриклеточные
стимулы с внеклеточными событиями [1]. Так, трансдукция фотосинтетического редокс-
сигнала в Chlamydomonas происходит с участием фосфорилирования хлоропластных белков
[2]. Высокая интенсивность освещения вызывает восстановление пула хлоропластных
биотиолов, что изменяет уровень транскрипции хлоропластных генов. Это происходит за
счет активации так называемой "пластидной транскрипционной киназы", которая
фосфорилирует ?-подобный фактор. Как известно, именно этот фактор играет
первостепенную роль в транскрипции хлоропластных генов [2].
Ранее мы показали, что ингибиторы протеинкиназ и протеинфосфатаз значительно
модифицируют эффекты редокс-агентов на активность синтеза белка в митохондриях злаков
[3]. На основании этих данных предложена схема редокс-контроля экспрессии
митохондриальных генов на уровне трансляции, основанная на участии в редокс-сигналинге
протеинкиназ и протеинфосфатаз [3].
Проведенный с помощью методов in silico анализ позволил установить, что ядерные
геномы риса и арабидопсиса кодируют 1100–1700 протеинкиназ [4], т.е. в 10 раз больше, чем
геном дрожжей (119 протеинкиназ) [4] и в 2–3 раза больше, чем геном человека (518
протеинкиназ) [6]. Это свидетельствует о том, что в клетках растений около 1000–2000
различных белков могут подвергаться модификации с помощью
фосфорилирования/дефосфорилирования. Предполагается, что в среднем в митохондриях
растений содержится около 50–200 протеинкиназ, столько же или больше белков-мишеней и
10–30 протеинфосфатаз [4].
В митохондриях арабидопсиса и гороха обнаружено более 10 протеинкиназ и одна
протеинфосфатаза [4]. В настоящее время в митохондриях растений идентифицировано
около 20 фосфобелков, участвующих в реализации митохондриальных функций: в регуляции
цикла трикарбоновых кислот, в активации субъединиц дыхательных комплексов II и III, в
реализации функций митохондриальных белков теплового шока (БТШ) и др. [7]. Считается,
что фосфорилирование БТШ22 кукурузы по остатку Ser59 влияет на его олигомеризацию,
которая является необходимым условием для проявления шаперонной активности этого
белка [8]. Предполагается, что фосфорилирование БТШ60, БТШ70, БТШ90, возможно, имеет
такое же значение [7].
Как известно, работа электрон-транспортной цепи митохондрий является одним из
основных источников АФК в клетке. Фосфорилирование Mn-содержащей
супероксиддисмутазы (MnСОД), одного из ферментов, вовлеченных в детоксикацию
свободных радикалов в митохондриях, служит указанием на то, что митохондриальный
обмен АФК регулируется [9].
Фосфорилирование белков в изолированных митохондриях кукурузы является
редокс-чувствительным [10]. Среди всех исследованных фосфобелков наибольшую
чувствительность к изменению редокс-условий проявляли пептиды с мол. м. около 66, 60, 55
и 48/50 кД. Фосфобелок с мол. м. около 66 кД был иммунохимически идентифицирован как
БТШ60 [10].
В настоящее время постулируется участие фосфорилирования митохондриальных
белков в трансдукции сигналов в митохондриях животных и дрожжей [11, 12]. Показано, что
цАМФ-зависимое фосфорилирование белков в митохондриях млекопитающих является
необходимым этапом в процессах трансдукции сигналов в клетке [11]. В митохондриях
млекопитающих цАМФ стимулирует некоторые протеинкиназы, которые фосфорилируют
две субъединицы дыхательного комплекса I, что является условием проявления их
активности [11]. Считается, что цАМФ может быть вовлечен в сигналинг и в растениях [4,
13]; однако вопрос о влиянии цАМФ на фосфорилирование митохондриальных белков
остается практически неизученным.
Таким образом, несмотря на то, что обратимое фосфорилирование белков широко
распространено в митохондриях высших организмов, физиологическое значение этого вида
посттрансляционной модификации белков во многом остается малоизученным.
Целью настоящей работы было исследование влияния различных внутриклеточных
сигналов на уровень фосфорилирования белков митохондрий растений, изучение
протеинкиназной активности в митохондриях проростков кукурузы и выявление типа
изучаемых протеинкиназ и протеинфосфатаз.

МЕТОДИКА
В работе использовали 4-дневные этиолированные проростки кукурузы (Zea mays L.,
гибрид ВИР 42МВ).
Получение митохондрий. Митохондрии выделяли из колеоптелей методом
дифференциального центрифугирования с последующей очисткой в градиенте плотности
сахарозы [14].
Лизис митохондрий. Осадок митохондрий ресуспендировали в 2 мл буфера для
лизиса, содержавшего 25 мМ Трис–HCl, pH 7.8, 600 мМ KCl, 1 мМ ЭДТА, 10% глицерин, 14
мМ 2-меркаптоэтанол, 0.5 мМ ФМСФ, 0.01% БСА. После ресуспендирования митохондрий к
смеси добавляли 10% водный раствор Тритона Х-100 до конечной концентрации 0.5%. Лизат
инкубировали 15 мин при температуре 4?C при постоянном встряхивании.
Центрифугирование осуществляли при 15 000 g в течение 15 мин (центрифуга К-24, “MLW”,
Германия). Супернатант отбирали и подвергали диализу против буфера А (20 мМ Трис–HCl,
pH 7.8, 50 мМ KCl, 1 мМ ЭДТА, 5 мМ 2-меркаптоэтанол, 0.5 мМ ФСМФ, 10% глицерин) в
течение 1.5–2.0 ч и далее сохраняли при ?20°С.
Гель-фильтрацию проводили на колонке с Sephadex G-200 (“Pharmacia”, Швеция).
Диализованный лизат митохондрий (0.6 мл) наносили на колонку (1.1 ? 65.5 см),
уравновешенную буфером для хроматографии (БХ), содержавшим 25 мМ Трис–HCl, pH 7.8,
50 мМ KCl, 0.5 мМ ЭДТА, 10% глицерин, 14 мМ 2-меркаптоэтанол, 0.5 мМ
фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ). Элюцию белков проводили этим же буфером при
температуре 4°С со скоростью 5.5 мл/ч. Собранные с помощью коллектора (“LKB”, Швеция)
фракции объемом 0.92 мл сохраняли при температуре –20°С.
Ионообменная хроматография. Диализат объединенных фракций, полученных гель-
фильтрацией и обладающих протеинкиназной активностью, наносили на колонку (3.6 ? 1.5
см) с ДЭАЭ-Toyopearl (“Toyo-Soda”, Япония). Колонку промывали тремя объемами БХ.
Белок элюировали с помощью линейного градиента концентрации KCl (0.05–1 М) в БХ при
скорости 10–12 мл/ч. Фракции отбирали и хранили при температуре –20°С.
Определение ферментативной активности. Протеинкиназную активность
определяли после электрофореза в ДДС–ПААГ, согласно [15]. К анализируемым образцам
добавляли буфер для образцов, содержавший 2% ДДС, 10% сахарозу, 5% 2-меркаптоэтанол,
60 мМ Трис–HCl (pH 6.8), 10% глицерин и 0.1% бромфеноловый синий; инкубировали 2–3
мин при комнатной температуре и фракционировали в системе Laemmli [16] с небольшой
модификацией. До полимеризации разделяющего геля в него добавляли казеин в
концентрации 1 мг/мл. После электрофореза ДДС удаляли из геля с помощью трехкратной
промывки раствором 25 мМ Трис–HCl (pH 7.5) в течение 30 мин при комнатной
температуре. Затем фермент ренатурировали в буфере следующего состава: 25 мМ Трис–
HCl, 7.5, 0.5 мМ ДТТ при 4?С в течение 24 ч. После ренатурации гель инкубировали 15 ч при
комнатной температуре в 20 мл буфера для фосфорилирования in vitro с добавлением 2.5 нМ
(200 мкКи) ?-32Р-ATФ (“ИРМ”, Россия). Реакцию останавливали 5% раствором ТХУ. Затем
гель несколько раз промывали этим раствором для отмывки от невключившейся ?-32Р-ATФ.
Гель окрашивали в водном растворе, содержавшем 0.2% Кумасси R-250, 25% изопропанол и
10% уксусную кислоту, в течение 60 мин. Для обесцвечивания фона гель переносили в
раствор, содержавший 10% уксусную кислоту и 12% изопропанол, после чего высушивали
на стеклянной подложке под слоем бумаги Whatman 3ММ. Гель экспонировали с
рентгеновской пленкой марки Kodak.
Фосфорилирование белков in vitro проводили, как в работе [17]. Осадок
митохондрий или фракции после хроматографии на ДЭАЭ-Toyopearl ресуспендировали в 50
мкл буфера, содержавшего 0.3 М сахарозу, 50 мМ Hepes–KOH, pH 7.5, 5 мМ MgCl2, 0.1 мМ
СaCl2 и 0.2 мМ (0.4–1.0 Ки/ммоль) ?-32Р-ATФ (“ИРМ”), а также соответствующие
ингибиторы протеинкиназ и протеинфосфатаз, цАМФ и CaCl2. Инкубацию проводили в
течение 15–20 мин при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением буфера
для образцов. Смесь прогревали при температуре 100?С в течение 2 мин. Полученные пробы
хранили при температуре – 20?С.
Полипептидный состав фосфорилированных белков анализировали в системе
Laemmli [16]. Электрофорез проводили в 12.5% ПААГ в присутствии ДДС. Гели окрашивали
в течение 60 мин 0.2% раствором Кумасси R-250 в 25% изопропаноле и 10% уксусной
кислоте, затем отмывали (как описано выше), высушивали и экспонировали с рентгеновской
пленкой марки Kodak. Полученные радиоавтографы сканировали и обрабатывали с помощью
программы SigmaGel (“PKWARE”, США). Результаты анализа представлены на диаграммах
как отношение интенсивности сигнала радиоактивно меченного полипептида в условиях той
или иной обработки к интенсивности сигнала того же полипептида в контрольных условиях,
принятой за 100%. Статистическую обработку проводили с помощью пакета программ
Microsoft Excel на основании данных трех независимых экспериментов.
Определение белка. Концентрацию белка в изолированных митохондриях
определяли методом Lowry с соавт. [18].
Реактивы. В работе использовали реактивы производства фирмы “Sigma” (CША).

РЕЗУЛЬТАТЫ
Определение протеинкиназной активности
Нами была предпринята попытка определения спектра протеинкиназ в митохондриях
кукурузы. Для этого определяли активность фермента в геле после электрофореза в ПААГ с
использованием казеина в качестве субстрата фосфорилирования (рис. 1). С этой целью
использовали как митохондрии, так и белковые фракции, полученные путем
последовательной хроматографии митохондриального солюбилизата на колонках с Sephadex
G-200 и ДЭАЭ-Toyopearl. В использованных нами условиях проявлялась одна молекулярная
форма протеинкиназы. Максимальная активность этой формы определялась в
митохондриальных экстрактах кукурузы, тогда как в белковых фракциях, полученных гель-
фильтрацией, она присутствовала в сравнительно небольших количествах (рис. 1, дорожка
2). Во фракциях после хроматографии на ДЭАЭ-Toyopearl протеинкиназная активность не
проявлялась (рис. 1, дорожка 3). При определении активности фермента в геле
фосфорилирование субстрата происходит в позиции, соответствующей мол. м. киназы.
Отсюда следует, что как в митохондриях, так и в очищенных гель-фильтрацией белковых
фракциях выявляется одна молекулярная форма протеинкиназы размером около 94 кД.
Очевидно, что эта киназа может быть как мономером с мол. м. 94 кД, так и одной из
субъединиц в составе мультимерного комплекса.

Влияние ингибиторов протеинкиназ и протеинфосфатаз на фосфорилирование
белков в изолированных митохондриях
Определение активности фосфорилирования белков in organello с помощью введения
радиоактивно меченного фосфата является одним из прямых методов изучения
протеинкиназной активности в митохондриях. Инкубация изолированных митохондрий с ?-
32Р-ATФ четко выявила фосфорилирование десяти полос с мол. м. 77, 74, 67.5, 66, 61, 60, 59,
51.5, 37 и 33 кД (рис. 2а), кроме того в следовых количествах отмечалось фосфорилирование
полипептидов с мол. м. около 27 и 17.5 кД (рис. 2а). Фосфобелок с мол. м. около 66 кД был
ранее нами иммунохимически идентифицирован как БТШ60 [10].
С помощью методики фосфорилирования белков in organello мы установили, что
стауроспорин (200 нМ), ингибитор ряда Ca2+-регулируемых протеинкиназ, не оказывал
заметного действия на уровень фосфорилирования как в митохондриальных экстрактах, так
и во фракциях белков, полученных после хроматографии с использованием ДЭАЭ-Toyopearl
(рис. 2, дорожка 2; рис. 4, дорожка 2). При этом окрашивание белков Кумасси R-250 не
выявило количественных различий в содержании исследованных белков митохондрий (рис.
2б).
Ингибитор казеиновых киназ гепарин (10 мкг/мл) оказывал заметный ингибирующий
эффект на уровень фосфорилирования белков во фракциях, очищенных путем
хроматографии с использованием ДЭАЭ-Toyopearl (рис. 4, дорожка 5), в отличие от
изолированных митохондрий (рис. 2, дорожка 5; рис. 3), где подобный эффект отсутствовал.
Таким образом, казеиновые киназы, по-видимому, играют более заметную роль в
фосфорилировании белковых фракций, очищенных путем ионообменной хроматографии.
В целом, специфические ингибиторы разных типов протеинкиназ оказывали
различные эффекты на активность фосфорилирования в зависимости от того, использовались
ли интактные органеллы или фракции белков, очищенных хроматографией на ДЭАЭ-
Toyopearl. Гепарин (но не стауроспорин) оказывал заметный ингибирующий эффект в
отношении фосфорилирования очищенных хроматографией белков, но не белков интактных
митохондрий.
Эндотол в концентрации 1 мкМ является ингибитором PP2A фосфатаз, а в
концентрации 50 мкМ ингибитором как PP2A, так и PP1A фосфатаз. Как видно из рис. 3,
эндотол в низких концентрациях не оказывал заметного эффекта на фосфорилирование
белков изолированных митохондрий. При более высоких концентрациях этого ингибитора
несколько увеличивался уровень фосфорилирования белков с мол. м. 77 и 74 кД. Подобное
действие ингибитора согласуется с литературными данными об активировании рядом
ингибиторов фосфатаз уровня фосфорилирования белков [17, 19]. Таким образом, можно
предположить, что в митохондриях кукурузы присутствуют PP1A фосфатазы, являющиеся
участниками обратимого фосфорилирования/дефосфорилирования митохондриальных
белков растений.

Влияние внутриклеточных сигналов (Ca2+, цАМФ) на уровень
фосфорилирования/дефосфорилирования митохондриальных белков
Установленное нами ранее влияние редокс-состояния электрон-транспортной цепи и
редокс-системы глутатиона на активность митохондриальной трансляции позволило сделать
вывод о существовании редокс-регуляции генетических функций митохондрий [3, 20]. Были
получены экспериментальные данные, указывающие на участие
фосфорилирования/дефосфорилирования митохондриальных белков в этом регуляторном
механизме [3]. В продолжение этих исследований представляло значительный интерес
исследовать возможное участие цАМФ и ионов Ca2+ в этой регуляторной системе.
Присутствие в среде фосфорилирования цАМФ (50 мкМ) приводило к снижению
фосфорилирования ряда полипептидов, как в целых митохондриях, так и во фракциях,
полученных путем хроматографии на колонке с ДЭАЭ-Toyopearl (рис. 2, дорожка 7; рис. 4,
дорожка 7). Возможно, в данной системе цАМФ действует не как активатор цАМФ-
зависимых протеинкиназ, а как активатор фосфатаз. Регуляция дефосфорилирования
некоторых белков с участием цАМФ была показана для митохондрий млекопитающих [21,
22]. Signorile с соавт. [22] обнаружили, что серин/треониновые фосфатазы действуют на
цАМФ-зависимые фосфобелки с неизвестной функцией в митохондриях сердца быка.
Обнаруженное нами снижение уровня фосфорилирования белков в присутствии цАМФ
указывает на возможное участие этой сигнальной молекулы в регуляции
фосфорилирования/дефосфорилирования в митохондриях растений.
Ионы Ca2+ – широко распространенные внутриклеточные мессенджеры как в
физиологических, так и в индуцируемых стрессом сигнальных путях во всех живых клетках.
Изменение концентрации свободного Ca2+ может быть "сигналом", приводящим к
соответствующему метаболическому ответу клеточных органелл [23].
Для исследования влияния ионов Ca2+ изолированные митохондрии обрабатывали
CaCl2 в концентрации 2 мМ. Подобную концентрацию использовали ранее в работе [24], где
показано, что обработка митохондрий проростков пшеницы ионами Ca2+ в концентрации
0.5–2.5 мМ вызывала высокоамплитудное набухание митохондрий, свидетельствующее об
открытии МPT-поры (другими словами, поры митохондриальной мегапроницаемости от
mitochondrial permeability transition). Максимум набухания отмечали при концентрации 2.5
мМ. Как известно, в митохондриях животных открытие поры приводит к потере
мембранного потенциала и выходу цитохрома с из межмембранного пространства в
цитозоль, что является сигналом для запуска апоптоза [25]. Существование подобного
механизма показано и для митохондрий растительных клеток [26]. Следует отметить, что не
было обнаружено каких-либо изменений в ультраструктуре внутренней мембраны
митохондрий пшеницы при их инкубации с 2.5 мМ Ca2+ [24].
Использование CaCl2 в концентрации 2 мМ увеличивало уровень фосфорилирования
белков с мол. м. около 74, 60 и 33 кД и в то же время значительно снижало активность
фосфорилирования белка с мол. м. около 51.5 кД по сравнению с контролем (рис. 2, дорожка
8). В присутствии этого агента в изолированных митохондриях дополнительно
фосфорилируется полипептиды с мол. м. 66 и 59 кД. Следует отметить, что изменение
активности фосфорилирования ряда белков, индуцируемое обработкой CaCl2, сходно по
своему характеру с действием циклоспорина А, ингибитора МPT-поры (рис. 2, дорожка 6).
Как было показано ранее, в митохондриях высших растений присутствуют редокс-
чувствительные протеинкиназы и протеинфосфатазы [10]. Известно, что циклоспорин А и
ионы Ca2+ могут изменять проницаемость мембран за счет индукции различных ионных
каналов [10, 27]. Таким образом, обработка этими агентами приводит к изменению редокс-
состояния органелл, что отражается на активности фосфорилирования белков.

ОБСУЖДЕНИЕ
В настоящей работе впервые в митохондриях кукурузы обнаружена казеиновая
протеинкиназа с мол. м. 94 кД. При ее предварительной характеристике мы использовали как
изолированные митохондрии, так и фракции очищенных с помощью аффинной и
ионообменной хроматографий белков. Отметим, что как было показано нами ранее [10],
фракции различаются по спектру фосфобелков и их количеству. Как следует из рис. 1, во
фракциях после хроматографии на ДЭАЭ-Toyopearl киназная активность не выявлялась.
Причиной этого может быть, на наш взгляд, особенность данного метода определения
активности фермента, выражающаяся в необходимости высоких концентраций белка по
сравнению с анализом фосфорилирования белков in vitro. В изолированных митохондриях
концентрация белка составляла около 10 мг/мл, тогда как во фракциях, полученных путем
очистки на колонке с Sephadex G-200 – до 50 мкг/мл, а в полученных ионообменной
хроматографией фракциях – не более 1 мкг/мл. При этом фосфорилирование in vitro
показало, что во фракциях после хроматографии на ДЭАЭ-Toyopearl обнаруживается больше
фосфобелков, чем в изолированных митохондриях (рис. 2 и 4).
Ингибиторный анализ показал, что ингибитор казеиновых киназ гепарин действовал
различным образом в отношении очищенных хроматографией белков и целых митохондрий.
Это могло быть результатом либо (1) особенностей протеинкиназ митохондрий растений по
отношению к стандартно используемым ингибиторам, либо (2) сложными взаимодействиями
протеинкиназ в конкуренции за субстрат. Так, при ингибировании одного класса
протеинкиназ протеинкиназы другого класса фосфорилируют доступные субстраты, в
результате чего наблюдается картина отсутствия ингибирования протеинкиназной
активности. Возможно, оба этих фактора действовали одновременно.
Стауроспорин, ингибитор серин/треониновых протеинкиназ, не оказывал заметного
влияния на активность фосфорилирования белков, как в интактных митохондриях, так и при
использовании очищенных хроматографией белков. Подобное действие стауроспорина было
показано нами и ранее [10].
Как известно, цАМФ – один из ключевых вторичных мессенджеров во многих живых
организмах от Dictyostelium до Homo sapiens [13]. Вопрос, могут ли растения использовать в
качестве сигнала цАМФ, долгое время оставался открытым. Успехи в изучении
растительных белков, участвующих в синтезе и гидролизе молекул цАМФ, таких как
аденилатциклаза и фосфодиэстераза, позволили в настоящее время положительно решить
данную проблему. Результаты экспериментов с использованием экзогенного цАМФ
свидетельствуют об его участии в сигналинге у высших растений [13].
В нашей модели с использованием растительных митохондрий цАМФ оказывал
ингибирующее действие на активность фосфорилирования ряда митохондриальных белков.
Не исключено, что механизмы цАМФ-зависимой регуляции с участием фосфорилирования
белков в митохондриях растений отличаются от таковых в митохондриях млекопитающих и
дрожжей. В митохондриях животных и дрожжей [4] цАМФ действует через протеинкиназы
А. До настоящего времени в митохондриях растений не обнаружена ни одна протеинкиназа
А. Предполагается, что в растительных митохондриях цАМФ действует через другие
протеинкиназы [28]. Так, субъединицы дыхательного комплекса I растений являются
мишенью для МАП-киназ, а не для протеинкиназ А в отличие от митохондрий животных и
дрожжей. Предполагается, что именно фосфорилирование субъединицы дыхательного
комплекса I с мол. м. 23 кД МАП-киназами опосредует регуляцию его активности [28].
Использование изолированных митохондрий является удобной модельной системой
для исследования различных физиологических процессов, в частности для моделирования
различных стрессовых условий. Как показано ранее [24], Ca2+ в диапазоне концентраций 1–
2.5 мМ запускает в митохондриях злаков события, связанные с начальными стадиями
апоптоза (в частности, высокоамплитудное набухание митохондрий). Обработка
митохондрий кукурузы ионами Ca2+ в высоких концентрациях, моделирующая начальные
стадии апоптоза, приводила к увеличению фосфорилирования ряда белков, а также
дополнительному фосфорилированию белка с мол. м. около 59 и 66 кД по сравнению с
контролем (рис. 2, дорожка 8). Данные об увеличении уровня фосфорилирования отдельных
митохондриальных белков под действием ионов кальция получены нами впервые. Ранее
показано [29], что при обработке митохондрий из сердца свиньи ионами Ca2+ в концентрации
100 мкМ (соответствует высокоамплитудному набуханию митохондрий, выходу цитохрома
с, т.е. начальным событиям апоптоза) уменьшается уровень фосфорилирования
пируватдегидрогеназы и MnСОД. В работе Azarashvilli с соавт. [30] установлено, что
соответствующие выходу цитохрома с концентрации Ca2+ вызывают дефосфорилирование
субъединицы с F0F1-AТФазы в митохондриях животных. В противоположность этим данным
обнаруженная в данной работе активация фосфорилирования ряда растительных
митохондриальных белков (среди которых присутствует и БТШ60) под влиянием Ca2+,
позволяет предполагать различную роль фосфорилирования белков в процессе апоптоза у
высших растений и животных.
В целом, на основании проведенных исследований и полученных нами ранее данных
[3] мы предполагаем, что редокс-зависимое фосфорилирование/дефосфорилирование
митохондриальных белков может играть важную роль в передаче регуляторных сигналов в
клетках высших растений. В настоящее время, однако, нельзя исключить, что в списке
внутриклеточных мессенджеров, участвующих в сигналинге в митохондриях, кроме ионов
Ca2+ и цАМФ могут быть и другие сигнальные молекулы (например, АФК).
Работа выполнена при финансовой поддержке грантов Российского фонда
фундаментальных исследований (№ 07-04-01341-а и № 08-04-01426-а) и Сибирского
отделения Российской академии наук (междисциплинарные интеграционные проекты 6 и
98).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Pagliarini D.J., Dixon J.E. Mitochondrial Modulation: Reversible Phosphorylation Takes
Center Stage? // Trends Biochem. Sci. 2006. V. 31. P. 26-34.
2. Pfannschmidt T. Chloroplast Redox Signals: How Photosynthesis Controls Its Own Genes //
Trends Plant Sci. 2003. V. 8. P. 33-41.
3. Cубота И.Ю., Арзиев А.Ш., Константинов Ю.М. Участие реакций фосфорилирования–
дефосфорилирования белков в редокс-контроле трансляции в митохондриях злаков //
Физиология растений. 2004. Т. 51. С. 872-877.
4. Juszczuk I.M., Bykova N.V., Moller I.M. Protein Phosphorylation in Plant Mitochondria //
Physiol. Plant. 2007. V. 129. P. 90-103.
5. Wang D., Harper J.F., Gribskov M. Systematic Trans-Genomic Comparison of Protein
Kinases between Arabidopsis and Saccharomyces cerevisiae // Plant Physiol. 2003. V. 132. P.
2152-2165.
6. Manning G., Whyte D.B., Martinez R., Hunter T., Sudarsanam S. The Protein Kinase
Complement of the Human Genome // Science. 2002. V. 298. P. 1912-1934.
7. Bykova N.V., Egsgaard H., Moller I.M. Identification of 14 New Phosphoproteins Involved in
Important Plant Mitochondrial Processes // FEBS Lett. 2003. V. 540. P. 141-146.
8. Lund A.A., Rhoads D.M., Lund A.L., Cerny R.L., Elthon T.E. In Vivo Modifications of the
Maize Mitochondrial Small Heat Stress Protein, HSP22 // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P.
924-929.
9. Moller I.M. Plant Mitochondria and Oxidative Stress. Electron Transport, NADPH Turnover
and Metabolism of Reactive Oxygen Species // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol.
2001. V. 52. P. 561-591.
10. Субота И.Ю., Арзиев А.Ш., Сенженко Л.П., Тарасенко В.И., Константинов Ю.М.
Ингибиторный анализ фосфорилирования/дефосфорилирования белков в митохондриях
кукурузы в зависимости от редокс-условий // Физиология растений. 2007. Т. 54. С. 389-
396.
11. Papa S., Sardanelli A.M., Scacco S., Petruzzella V., Technikova-Dobrova Z., Vergari R.,
Signorile A. The NADH: Ubiquinone Oxidoreductase (Complex I) of the Mammalian
Respiratory Chain and the cAMP Cascade // J. Bioenerg. Biomembr. 2002. V. 34. P. 1-10.
12. Livigni A., Scorziello A., Agnese S., Andronetto A., Carlucci A., Garbi C., Castaldo I.,
Annunziato L., Avvedimento E.V., Feliciello A. Mitochondrial AKAP121 Links cAMP and Scr
Signaling to Oxidative Metabolism // Mol. Biol. Cell. 2006. V. 17. P. 263-271.
13. Assmann S.M. Cyclic AMP as Second Messenger in Higher Plants // Plant Physiol. 1995. V.
108. P. 885-889.
14. Konstantinov Yu.M., Lutsenko G.N., Podsosonny V.A. Inhibition of Adenine Nucleotide
Translocation in Maize Seedling Mitochondria by Anionic Detergents // Physiol. Plant. 1988.
V. 72. P. 403-406.
15. Geahlen R.L., Austario M., Low P.S., Harrison M.L. Detection of Protein Kinase Activity in
Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gels // Anal. Biochem. 1986. V. 153. P. 151-158.
16. Laemmli U.K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of Head of Bacteriophage
T4 // Nature. 1970. V. 277. P. 174-182.
17. Struglics A., Fredlund K.M., Konstantinov Yu.M., Allen J.F., Moller I.M. Protein
Phosphorylation/Dephosphorylation in the Inner Membrane of Potato Tuber Mitochondria //
FEBS Lett. 2000. V. 475. P. 213-217.
18. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein Measurements with the Folin
Phenol Reagent // J. Biol. Chem. 1951. V. 193. P. 265-275.
19. Hulley P., Davison A. Regulation of Tyrosine Phosphorylation Cascades by Phosphatases:
What the Actions of Vanadium Teach Us // J. Trace Elem. Exp. Med. 2003. V. 16. P. 281-
290.
20. Константинов Ю.М., Субота И.Ю., Арзиев А.Ш. Влияние редокс-системы глутатиона
на трансляционную активность митохондрий кукурузы // Докл. РАН. 1999. Т. 365. С.
126-128.
21. Feliciello A., Gottesman M.E., Avvedimento E.V. cAMP-PKA Signaling to the Mitochondria:
Protein Scaffolds, mRNA and Phosphatases // Cell Signal. 2005. V. 17. P. 279-287.
22. Signorile A., Sardanelli A.M., Nuzzi R., Papa S. Serine (Threonine) Phosphatase(s) Acting on
cAMP-Dependent Phosphoproteins in Mammalian Mitochondria // FEBS Lett. 2002. V. 512.
P. 91-92.
23. Hepler P.K. Calcium: A Central Regulator of Plant Growth and Development // Plant Cell.
2005. V. 17. P. 2142-2155.
24. Virolainen E., Blokhina O., Fagerstedt K. Ca2+-Induced High Amplitude Swelling and
Cytochrome c Release from Wheat (Triticum aestivum L.) Mitochondria under Anoxic Stress
// Ann. Bot. 2005. V. 90. P. 509-516.
25. Bernardi P., Scorrano L., Collona R., Peronilli V., di Lisa F. Mitochondria and Cell Depth.
Mechanistic Aspects and Methodological Issues // Eur. J. Biochem. 1999. V. 264. P. 687-701.
26. Tiwari B.S., Belenghi B., Levine A. Oxidative Stress Increased Respiration and Generation of
Reactive Oxygen Species, Resulting in ATP Depletion, Opening of Mitochondria
Permeability Transition, and Programmed Cell Death // Plant Physiol. 2002. V. 128. P. 1271-
1281.
27. Petrussa E., Casolo V., Braidot E., Chiandussi E., Macri F., Vianello A. Cyclosporin A
Induces the Opening of a Potassium-Selective Channel in Higher Plant Mitochondria // J.
Bioenerg. Biomembr. 2001. V. 33. P. 107-117.
28. Feilner T., Hultschig C., Lee J., Meyer S., Immink R.G.H., Koening A., Possling A., Seitz H.,
Beveridge A., Scheel D., Cahill D.J., Lehrach H., Kreutzberger J., Kersten B. High
Throughput Identification of Potential Arabidopsis Mitogen-Activated Protein Kinases
Substrates // Mol. Cell. Proteomics. 2005. V. 4. P. 1558-1568.
29. Hopper R.K., Carroll S., Aponte A.M., Johnson D.T., French S., Shen R.-F., Witzmann F.A.,
Harris R.A. Balaban R.S. Mitochondrial Matrix Phosphoproteome: Effect of Extra
Mitochondrial Calcium // Biochemistry. 2006. V. 45. P. 2524-2536.
30. Azarashvilli T.S., Tyynela J., Odinokova I.V., Grigorjev P.A., Baumann M., Evdodienko Y.M.,
Saris N.E. Phosphorylation of Peptide Related to Subunit c of the F0F1-ATPase/ATP Syntase
and Relationship to Permeability Transition Pore Opening in Mitochondria // J. Bioenerg.
Biomembr. 2002. V. 34. P. 279-284.

ПОДПИСИ К РИСУНКАМ

Рис. 1. Определение протеинкиназной активности в геле.
1 – митохондриальный экстракт кукурузы; 2 – фракции, полученные гель-фильтрацией на
колонке Sephadex G-200; 3 – фракции после хроматографии на ДЭАЭ-Toyopearl.

Рис. 2. Влияние ингибиторов протеинкиназ, протеинфосфатаз и различных сигнальных
молекул на уровень фосфорилирования митохондриальных белков кукурузы (a) и
полипептидный состав препаратов митохондриальных белков, полученных после инкубации
с ними органелл (б).
После фракционирования в ДДС?ПААГ белки окрашивали Кумасси R-250. 1 – контроль; 2 –
стауроспорин (200 нМ); 3 – эндотол (1 мкМ); 4 – эндотол (50 мкМ); 5 – гепарин (10 мкг/мл);
6 – циклоспорин А (1 мкМ); 7 – цАМФ (50 мкМ); 8 – CaCl2 (2 мМ).

Рис. 3. Количественные изменения интенсивности фосфорилирования трех
митохондриальных белков кукурузы под воздействием ингибиторов протеинкиназ,
протеинфосфатаз и сигнальных молекул.
1 – белок 74 кД; 2 – белок 67.5 кД; 3 – белок 51.5 кД.

Рис. 4. Эффект ингибиторов протеинкиназ, протеинфосфатаз и различных сигнальных
молекул на уровень фосфорилирования митохондриальных белков кукурузы во фракциях
после хроматографии на ДЭАЭ-Toyopearl.
1 – контроль; 2 – стауроспорин (200 нМ); 3 – эндотол (1 мкМ); 4 – эндотол (50 мкМ); 5 –
гепарин (10 мкг/мл); 6 – циклоспорин А (1 мкМ); 7 – цАМФ (50 мкМ); 8 – CaCl2 (2 мМ).