УДК 581.1
РЕГЕНЕРАЦИЯ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ ГЕН gfp ИЗ семядольных и листовых эксплантОВ рапса: ВЛИЯНИЕ ГЕНОТИПА И АБК
© 2012 г. Т. Ж. Хоанг*, Г. Н. Ралдугина**
* Российский государственный аграрный университет – МСХА им. К.А. Тимирязева, Москва
** Учреждение Российской академии наук
Институт физиологии растении им. К.А. Тимирязева РАН, Москва
Поступила в редакцию 16.02.2011 г.
Cемядоли пятидневных проростков и листья шестинедельных растений двух сортов рапса (Brassica napus L., сорта Вестар и Подмосковный) сокультивировали с культурой Agrobacterium tumefaciens, содержащей генетическую конструкцию с маркерным геном gfp, на МС-среде с добавлением БАП, НУК и АБК в разных сочетаниях. Способность к регенерации на обоих типах эксплантов была достаточно высока, но у листовых эксплантов сформированные побеги были слабо дифференцированы и у большинства наблюдалась витрификация. Частота регенерации на семядольных эксплантах обоих сортов растений-трансформантов, экспрессирующих ген gfp, была более 70%, однако она была значительно ниже при использовании листовых эксплантов (47% у сорта Вестар и 28% у сорта Подмосковный). Ген gfp экспрессировался на всех стадиях развития побега. На первичном начинающем дифференцироваться каллусе мы наблюдали наиболее сильную флуоресценцию белка GFP в меристематической и сосудистой тканях. На листовых пластинках свечение белка GFP было значительно ярче на старых листьях, чем на молодых, при этом оно часто наблюдалось только в группах клеток. При проведении ПЦР-анализа семенного поколения растений-трансформантов обнаружили, что у некоторых растений не соблюдались менделевские правила наследования моногенного признака (трансгена) для самоопыленных растений. Это явление может объясняться либо как результат мейотической рекомбинации, либо образованием при регенерации генотипических химер.

---------------------------------------
Сокращение: Цф  цефотаксим.
Адрес для корреспонденции: Ралдугина Галина Николаевна. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН. Электронная почта: galina@ippras.ru
Ключевые слова: Brassica napus  регенерация  трансформация  gfp

Введение

В последние годы широко разрабатываются методы биотехнологии, способствующие решению многих проблем селекционного процесса. Большие возможности в создании новых форм организмов дает использование методов генетической инженерии, предоставляющих возможность переносить чужеродные гены в реципиентные организмы, что позволяет преодолевать межвидовые барьеры и передавать отдельные наследственные признаки одних организмов другим. Растения имеют важное преимущество перед животными  они обладают тотипотентностью, т.е возможна их регенерация in vitro из недифференцированных соматических тканей с получением нормальных фертильных растений. Это свойство дает возможность создания трансгенных растений и изучения функционирования введенных в растения генов. Как известно, одним из доказательств трансгенности является наследование встроенных генов, поэтому очень важно понять, по каким причинам в некоторых случаях чужеродные гены не наследуются в потомстве.
При изучении наследования в растениях чужеродных генов для большинства созданных трансгенных растений было показано, что встроенные гены при наличии одной копии, как правило, наследуются в потомстве самоопыленных трансгенных растений, сегрегируя в отношении 3 : 1, т.е. эти гены наследуются как единый менделевский признак. Однако в некоторых случаях наблюдалось наследование совершенно в других соотношениях, например, из 100 проверенных семян только в 5, а в другом опыте в 12 проростках авторы наблюдали присутствие встроенного гена [1]. Такое явление очень затрудняет дальнейшую работу с полученными трансформированными растениями. Для того, чтобы исключить такое явление, необходимо понять причины, по которым у трансформированных растений не соблюдаются менделевские правила наследования моногенного признака. Одной из них может быть образование химер, т.е. организмов, состоящих из генетически неоднородных клеток.
Химерность растений-трансформантов описана у некоторых травянистых видов, например, табака [2, 3], сои [4], картофеля [5], риса [6], льна [7], капусты [8] и земляники [9], а также у древесных плодовых растений, например, у яблони [10] или у цитрусовых [11]. Полученные в некоторых случаях химеры составляли до 90% растений-регенерантов. Авторы по-разному объясняют причины возникновения химерных растений: формированием побегов одновременно из трансформированных и нетрансформированных клеток [12, 13], последствиями защиты нетрансформированных клеток от селективного агента окружающими трансформированными клетками [14, 15] или неэффективностью селективных агентов [16]. Однако этот вопрос совершенно не исследован, и авторы, показавшие образование химерных трансгенных растений, не обсуждали причины этого феномена.
Целью нашей работы являлся выбор условий, при которых регенерация трансформантов из семядольных или листовых эксплантов двух сортов ярового рапса происходила бы с наибольшей частотой с тем, чтобы в дальнейшем попытаться обнаружить зависимость формирования химерных растений от вида или генотипа экспланта. Для визуализации процесса формирования побегов трансформацию рапса проводили конструкцией, содержавшей ген gfp, который кодирует зеленый флуоресцирующий белок, светящийся при освещении ультрафиолетом.

Материалы и методы

В экспериментах использовали семядоли и листья ярового рапса (Brassica napus L.) сортов Вестар (канадской селекции) и Подмосковный (селекции ВНИИ кормов им. В.Р. Вильямса, любезно предоставленный сотрудниками этого института). Семядоли получали путем проращивания стерильных семян на среде, содержавшей макросоли по Murashige и Skoog [17] и 0.5% сахарозу без добавления растительных гормонов и витаминов. Все семена стерилизовали 70% спиртом и 20% раствором гипохлорита натрия, после чего промывали стерильной дистиллированной водой, а затем высаживали на агаризованную среду (0.7% агар-агар) и помещали на сутки в темноту, после чего переносили в световую камеру. Через 5 суток срезанные с проростков семядольные листья использовали для получения эксплантов. Листовые экспланты получали со стерильных растений-регенерантов в возрасте 6 нед. Листовую пластинку с удаленной главной жилкой нарезали на сегменты по 5 мм и помещали нижней стороной на агаризованную среду для каллусогенеза (среда МС, 3% сахароза, 0.1 мг/л 2,4-Д, 4 мг/л кинетин, 2 мг/л НУК).
Для трансформации использовали генетическую конструкцию с геном gfp (рис. 1) в плазмиде pA3011, находящейся в Agrobacterium tumefaciens штамма AGL0. Конструкция была получена от сотрудников кафедры вирусологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова. Ген gfp содержал интрон, не позволяя ему экспрессироваться в бактериях. Культуру агробактерий выращивали в течение ночи при 2526°С на шейкере в жидкой среде LB, содержавшей 50 мг/л рифампицина и 50 мг/л канамицина.
Трансформацию проводили методом совместного культивирования эксплантов с агробактерией, находящейся на поверхности агаризованной среды [18] по ранее разработанному методу [19]. Суспензию “ночной” культуры A. tumefaciens наносили на среду для каллусогенеза, помещали на нее 5-дневные семядольные экспланты проростков или листовые сегменты по 3040 штук на чашку и инкубировали в течение 2 суток в темноте при температуре 25°С. Затем экспланты переносили на среду для морфогенеза (среда МС, 1% сахароза, БАП, НУК), дополненную антибиотиком цефатоксимом (Цф) (800 мг/л) и АБК (3 мг/л) и помещали в световую камеру. После двухнедельного выращивания экспланты переносили на среду для морфогенеза без AБК, также дополненную Цф (500 мг/л). Через 2–3 нед. экспланты переносили на питательную среду для роста побегов (среда МС, 1% сахароза), дополненную Цф (500 мг/л). Для листовых эксплантов в среду для морфогенеза добавляли 3 мг/л AgNO3. Сформированные побеги отделяли от каллуса и пересаживали на среду для укоренения, дополненную 300 мг/л Цф (1/2 концентрации макросолей, микросоли по МС, 1% сахароза, 0.1 мг/л НУК).
Флуоресценцию белка GFP наблюдали при освещении ткани синим светом (440–480 нм) с помощью микроскопов Axiophot и AxioImager (“Zeiss”, Германия).
Плазмидную ДНК выделяли методом щелочного лизиса бактериальных колоний [20]. Выделение ДНК из листьев растений-регенерантов проводили по методу Fulton с соавт. [21], растирая растительную ткань в жидком азоте. Для удаления РНК препарат ДНК обрабатывали РНКазой. Очищенную ДНК после оценки ее чистоты с помощью электрофореза в агарозном геле использовали для ПЦР, который проводили c использованием праймеров для гена gfp: прямой eGFP-FW 5’-CCTGAAGTTCATCTGCACCAC-3’ и обратный eGFP-RV 5’-ACTCCAGCAGGACCATGTGAT-3’, в амплификаторе Терцик (“ДНК-технология”, Пущино), по следующему протоколу: 94ºС – 4 мин, 30 циклов (94ºС – 60 с, 64ºС – 60 с, 72ºС – 60 с), 72ºС – 4 мин.
Амплифицированные фрагменты размером 512 п.н. разделяли электрофорезом в 0.8% агарозном геле; гели окрашивали бромистым этидием и фотографировали в ультрафиолетовом свете.
Частоту регенерации рассчитывали как отношение числа эксплантов, регенерировавших побеги, к общему числу эксплантов, помещенных на среду для каллусогенеза [22]. Частоту трансформации рассчитывали как отношение ПЦР-положительных растений к общему числу полученных регенерантов после проведения трансформации. Результаты экспериментов статистически обрабатывали с использованием программы Excel. χ2 рассчитывали, как описано Смиряевым и Кильчевским [23].

РЕЗУЛЬТАТЫ
Регенерация на эксплантах двух сортов рапса

Для успешной генетической трансформации растений необходимо, чтобы используемые экспланты обладали способностью к активному органогенезу. Для этого необходимо было изучить факторы, влияющие на органогенную способность семядольных и листовых эксплантов с высокой частотой побегообразования. Для растений рода Brassica многие исследователи наблюдали зависимость морфогенетического потенциала от применения разнообразных гормонов и от их соотношения [19, 20, 22, 24]. Мы добавляли регуляторы роста в различных концентрациях к среде для побегообразования, подсчитывая затем частоту образования побегов на листовых и семядольных эксплантах двух сортов рапса.
Из данных табл. 1 видно, что на частоту регенерации побегов на семядольных эксплантах обоих проверенных сортов сильно влияло добавление в среду культивирования АБК, увеличивая ее в 7–8 раз. У сорта Вестар самую высокую частоту регенерации на семядольных и листовых эксплантах получили на среде, содержавшей 3 мг/л АБК в присутствии 8 мг/л БАП и 1 мг/л НУК. Еще сильнее АБК влияла на образование побегов на эксплантах, полученных с растений сорта Подмосковный, образующих наибольшее количество побегов на семядольных эксплантах на среде, содержавшей 4 мг/л БАП, 0.5 мг/л НУК и 3 мг/л АБК, а для листовых эксплантов среда содержала 5 мг/л БАП, 1 мг/л НУК и 3 мг/л АБК. При этом во всех случаях регенерацию побегов наблюдали по срезанному краю экспланта, на котором вначале образовывался небольшой каллус, из которого в дальнейшем формировались морфогенные структуры.
Таким образом, в дальнейших экспериментах для трансформации мы использовали среды с обязательным добавлением АБК. Известно, что при проведении трансформации агробактерия сильно ингибирует побегообразование. В наших экспериментах было показано, что несмотря на это АБК стимулировала образование побегов и при наличии в среде агробактерий. Из данных, представленных в табл. 2, видно, что среда, содержавшая 8 мг/л БАП, 1 мг/л НУК и 3 мг/л АБК, была лучшей для проведения трансформации на семядольных эксплантах обоих сортов и на листовых эксплантах сорта Вестар. Однако морфология растений-регенерантов на разных эксплантах очень отличалась между собой. Большинство побегов, развивающихся на листовых эксплантах (около 75% от общего числа побегов), подвергалось витрификации. Это в значительной мере затруднило получение на них трансгенных растений.
ПЦР-анализ ДНК
Наличие гена gfp в геноме трансформированных растений было подтверждено с помощью ПЦР-анализа ДНК (рис. 2). Результаты, представленные в табл. 2, показывают, что частота образования растений-трансформантов была достаточно высокой (более 70%) у обоих сортов на семядольных эксплантах и в 2–3 раза ниже на листовых эксплантах.

Экспрессия гена gfp
Экспрессию гена gfp можно видеть при наблюдении под флуоресцентным микроскопом, как зеленое свечение белка GFP. При этом присутствие в трансформированных тканях встроенного гена не обязательно сопровождается его экспрессией. Как можно видеть из данных, представленных в табл. 3, зеленое свечение наблюдалось только у некоторых ПЦР-положительных по гену gfp растений, находясь в зависимости от вида и генотипа экспланта.
На семядольных эксплантах образовывалось большее число экспрессирующих ген gfp растений, и их было в 2–3 раза меньше на листовых эксплантах обоих сортов. Нужно отметить, что свечение белка GFP наблюдали на всех стадиях развития трансформированных растений – как на стадии первичного морфогенеза (через две недели после пересадки на среду для морфогенеза) – при образовании побегов, так и на всех стадиях развития растений в грунте. На каллусе мы наблюдали наибольшую флуоресценцию GFP в меристематической и сосудистой тканях (рис. 3а–3в). У сформировавшихся побегов свечение GFP наблюдали на листьях разных ярусов, при этом оно было значительно ярче на старых листьях, чем на молодых (рис. 3г и 3д) и лучше всего его можно было видеть на жилках, трихомах и устьицах (рис. 3е, 3ж и 3и). На стеблях и главной жилке листьев свечение наблюдалось почти во всех клетках (рис. 3к и 3л), однако на боковых жилках листьев флуоресценция тоже присутствовала и была интенсивнее, чем в клетках мезофилла и эпидермиса (рис. 3е). На листовой пластинке свечение часто проявлялось в группах клеток (рис. 3з). У контрольных нетрансформированных растений свечение ни в одном органе не наблюдали.

Изучение наследования гена gfp
Из трансформированных растений, полученных на семядольных эксплантах сорта Вестар, было выбрано 4 линии, хорошо экспрессирующих встроенный ген gfp. Эти растения укореняли в условиях in vitro и высаживали в почву. Растения были фертильны, и после самоопыления образовались хорошо сформированные семена, которые собирали с одного из цветоносов и проращивали в стерильных условиях. Из листьев проростков выделяли ДНК, в которой с помощью ПЦР проверяли наличие гена gfp. В табл. 4 представлены результаты анализа расщепления встроенного гена в растениях-потомках. Для растений линий 2 и 4, где χ2 меньше стандартного значения, видно, что в геноме родительских растений присутствовала одна вставка трансгена, тогда как для двух других растений наблюдалось значительное отклонение от расщепления 3 : 1, свидетельствуя об отклонениях от меделевского наследования.

обсуждение

Из работ многих авторов, получающих трансгенные растения с помощью методов культуры тканей, известно, что чем больше частота регенерации побегов, тем выше частота трансформации. Поэтому нам для достижения успеха в наших исследованиях необходимо было подобрать условия, при которых регенерация трансформантов происходила бы с наибольшей частотой на эксплантах различного вида и генотипа.
Было показано, что семядольные клетки обоих испытанных сортов рапса обладали более высоким потенциалом для регенерации растений, чем клетки листовых эксплантов. Добавление АБК в среду культивирования значительно повышало способность к регенерации побегов на семядольных эксплантах или вызывало регенерацию на листовых эксплантах (табл. 1), что подтвердило результаты проведенных нами ранее исследований на других сортах рапса [24]. Было показано также, что высокая частота трансформации, получаемая в наших опытах, зависела от присутствия в среде АБК (табл. 2). В предварительных опытах без добавления этого регулятора роста частота трансформации на всех типах эксплантов была очень мала, что не позволяло получить достаточное число растений для проведения опытов по изучению наследования трансгена. Важным результатом явилось то, что на листовых эксплантах сорта Подмосковный регенерация происходила только в процессе трансформации, свидетельствуя о том, что для стимуляции регенерации необходимы совершенно неожиданные компоненты среды. Например, в данном случае, по-видимому, антибиотик Цф, который повышал органогенез при получении растений-регенерантов пшеницы в других исследованиях [18]. Надо иметь в виду, что хотя существуют общие принципы подбора состава сред и регуляторов роста для преодоления физиологического барьера, препятствующего регенерации, в каждом конкретном случае каждым исследователем подбираются условия регенерации и трансформации, которые могут совершенно не подходить для других случаев.
Таким образом, можно отметить, что оба взятых нами сорта рапса фактически не различались по частоте регенерации на семядольных эксплантах, для которых наблюдали высокие частоты трансформации с хорошо дифференцированными побегами, что позволяло получать полностью сформированные растения.
На листовых эксплантах частота трансформации была значительно меньше. При этом побеги были плохо дифференцированы, и только из малого их числа формировались полноценные растения. Особенно плохо процесс дифференцировки наблюдался для листовых эксплантов сорта Подмосковный. Многие из образующихся побегов были витрифицированы или не полностью дифференцированы. Необходимо отметить, что процесс органогенеза на листовых эксплантах зависел от температуры, при которой происходило культивирование эксплантов. При температуре ниже 20ºС экспланты начинали темнеть на срезе, а затем погибали.
При ПЦР-проверке полученных трансформантов на наличие в них встраиваемого гена gfp было показано, что при использовании семядольных эксплантов число трансгенных побегов достаточно велико у обоих сортов, составляя почти 70% полученных растений-регенерантов, тогда как на листовых эксплантах их число было значительно меньше (табл. 3). Мы надеемся, что дальнейшие исследования позволят увеличить это значение.
При проверке трансгенности растений было показано, что некоторые из полученных растений экспрессировали ген gfp, причем свечение было видно в разных частях растений. В некоторых случаях оно наблюдалось только в клетках устьиц или в трихомах, а в некоторых случаях светились все части растения (рис. 3), отличаясь по своей интенсивности в зависимости от ткани растения. Свечение было значительно ярче на старых листьях (рис. 3г), чем на молодых (рис. 3д), что, по всей вероятности, связано с накоплением белка в зрелых клетках.
Повышение частоты трансформации увеличивало и число экспрессирующих трансген растений (табл. 3). Многие трансгенные растения, полученные на семядольных эксплантах обоих испытанных сортов, где частота трансформации достаточно высока, показывали флуоресценцию белка GFP, тогда как из числа растений, полученных на листовых эксплантах, светились лишь немногие.
При изучении наследования трансгена gfp (табл. 4) из общего числа трансформантов (94), экспрессирующих ген gfp, было случайным образом выбрано 4 растения, у 2 из которых наследование встроенного гена не подчинялось менделевским правилам расщепления для моногенного признака. Это, вполне вероятно, может свидетельствовать о химерности этих трансформированных растений, образовавшихся на семядольных эксплантах. При этом попытка определить, как именно происходит образование химер на первых стадиях регенерации, не увенчалась успехом. Использование для трансформации маркерного гена gfp не дало ясного ответа на вопрос о возможности обнаружения смешанной ткани, состоящей из клеток разного типа. Выявление химер, по-видимому, возможно только при получении семенного поколения растений, показавших наличие встроенного гена. При высаживании растений в почву при образовании цветоносных побегов, как правило, происходит “расхимеривание”, т.е. разделение химер на составляющие генотипы с преобладанием нетрансформированных клеток [25], так как адвентивные побеги обычно образуются из одного клеточного слоя, вовлеченного в их формирование. И только тогда, изучив семенное поколение многих трансгенных растений, можно будет сделать заключение о том, что может повлиять на образование химер.
Работа выполнена при частичной поддержке грантов Российского фонда фундаментальных исследований (№№ 10-04-00799-а; 09-08-01243-а), а также программы Президиума Российской академии наук “Молекулярная и клеточная биология”.
Список литературы
1.Kirk J.T.O., Tilney-Bassett R.A.E. Chimeras // The Plastids: Their Chemistry, Structure, Growth, and Inheritance / New York: Elsevier, 1987. V. 49. 329 p.
2.Schmülling T., Schell J. Transgenic Tobacco Plants Regenerated from Leaf Disks Can Be Periclinal Chimeras // Plant Mol. Biol. 1993. V. 21. P. 705-708.
3. Faize M., Faize L., Burgos L. Using Quantitative Real-Time PCR to Detect Chimeras in Transgenic Tobacco and Apricot and to Monitor Their Dissociation // BMC Biotechnol. 2010. V. 10. P. 53.
4.Christou P. Morphological Description of Transgenic Soybean Chimeras Created by the Delivery, Integration, and Expression of Foreign DNA Using Electric Discharge Particle Acceleration // Ann. Bot. 1990. V. 66. P. 379-386.
5.Rakosy-Tican E., Aurori C.M., Dijkstra C., Thieme R., Aurori A., Davey M.R. The Usefulness of the gfp Reporter Gene for Monitoring Agrobacterium-Mediated Transformation of Potato Dihaploid and Tetraploid Genotypes // Plant Cell Rep. 2007. V. 26. P. 661-671.
6.Christou P., Ford T.L. Recovery of Chimeric Rice Plants from Dry Seed Using Electric Discharge Particle Acceleration // Ann. Bot. 1995. V. 75. P. 449-454.
7. Dong J.Z., McHughen A. Transgenic Flax Plants from Agrobacterium-Mediated Transformation: Incidence of Chimeric Regenerants and Inheritance of Transgenic Plants // Plant Sci. 1993. V. 91. P. 139-148.
8. Berthomieu P., Béclin C., Charlot F., Doré C., Jouanin L. Routine Transformation of Rapid Cycling Cabbage (Brassica oleracea). Molecular Evidence for Regeneration of Chimeras // Plant Sci. 1994. V. 96. P. 223-235.
9. Mathews H., Wagoner W., Kellogg J., Bestwick R.K. Genetic Transformation of Strawberry: Stable Integration of a Gene to Control Biosynthesis of Ethylene // In Vitro Cell Dev. Biol. –Plant. 1995. V. 31. P. 36-43.
10. Flachowsky H., Riedel M., Reim S., Hanke V. Evaluation of the Uniformity and Stability of T-DNA Integration and Gene Expression in Transgenic Apple Plants // Electr. J. Biotechnol. 2008. V. 11. P. 1-15.
11.Costa M.G.C., Otoni W.C., Moore G.A. An Evaluation of Factors Affecting the Efficiency of Agrobacterium-Mediated Transformation of Citrus paradisi (Macf.) and Production of Transgenic Plants Containing Carotenoid Biosynthetic Genes // Plant Cell Rep. 2002. V. 21. P. 365-373.
12.Poethig S. Genetic Mosaics and Cell Lineage Analysis in Plants // Trends Genet. 1989. V. 5. P. 273-277.
13.Zhu X.Y., Zhao M., Ma S., Ge Y.M., Zhang M.F., Chen L.P. Induction and Origin of Adventitious Shoots from Chimeras of Brassica juncea and Brassica oleracea // Plant Cell Rep. 2007. V. 26. P. 1727-1732.
14.Park S.H., Rose S.C., Zapata C., Srivatanakul M., Smith R.H. Cross-Protection and Selectable Marker Genes in Plant Transformation // In Vitro Cell Dev. Biol.  Plant. 1998. V. 34. P. 117-121.
15.Domínguez A., Cervera M., Pérez R.M., Romero J., Fagoaga C., Cubero J., López M.M., Juárez J.A., Navarro L., Peña L. Characterization of Regenerants Obtained under Selective Conditions after Agrobacterium-Mediated Transformation of Citrus Explants Reveals Production of Silenced and Chimeric Plants at Unexpected High Frequencies // Mol. Breed. 2004. V. 14. P. 171-183.
16.Rakosy-Tican E., Aurori C.M., Dijkstra C., Thieme R., Aurori A., Davey M.R. The Usefulness of the gfp Reporter Gene for Monitoring Agrobacterium-Mediated Transformation of Potato Dihaploid and Tetraploid Genotypes // Plant Cell Rep. 2007. V. 26. P. 661-671.
17.Murashige T., Skoog F. A Revised Medium for Rapid Growth and Bioassay with Tobacco Tissue Culture // Physiol. Plant. 1962. V. 15. P. 472-493.
18. Данилова С.А., Кузнецов В.В., Долгих Ю.И. Новый эффективный метод трансформации кукурузы с использованием агробактериального газона // Физиология растений. 2009. Т. 56. С. 285-290.
19.Малышенко С.И., Тюлькина Л.Г., Зверева С.Д., Ралдугина Г.Н. Получение трансгенных растений Brassica campestris, экспрессирующих ген gfp // Физиология растений. 2003. T. 50. С. 309-315.
20.Ravanfar S. A., Aziz M.A., Kadir M.A., Rashid A.A., Sirchi M.H.T. Plant Regeneration of Brassica oleracea subsp. italic (Broccoli) cv. Green Marvel as Affected by Plant Growth Regulators // Afr. J. Biotechnol. 2009. V. 8. Р. 2523-2528.
21.Fulton T.M., Chunwongse J., Tanksley S.D. Protocol for Extraction of DNA from Tomato and Other Herbaceous Plants // Plant Mol. Biol. Rep. 1995. V. 13. P. 207-209.
22.Akasaka-Kennedy Y., Yoshida H., Takahata Y. Efficient Plant Regeneration from Leaves of Rapeseed (Brassica napus L.): The Influence of AgNO3 and Genotype // Plant Cell Rep. 2005. V. 24. P. 649-654.
23.Смиряев А.В., Кильчевский А.В. Генетика популяций и количественных признаков. М.: Колос, 2007.
24. Ралдугина Г.Н., Соболькова Г.И. Факторы, влияющие на органогенез у семядольных эксплантов рапса // Физиология растений. 1995. Т. 42. С. 916-922.
25.Pogany M.F., Lineberger R.D. Plant Chimeras in Tissue Culture: A Review // http://aggiehorticulture.tamu.edu/ tisscult/chimeras/chimera.html
Подписи к рисункам

Рис. 1. Схема генетической конструкции, использованной для трансформации семядольных и листовых эксплантов рапса.
35S – последовательность промотора из генома вируса мозаики цветной капусты (35S CaMV); GFPs – последовательность модифицированного гена зеленого флуоресцентного белка; 3’NTR – 3’-нетранслируемая последовательность; Nos – терминирующая последовательность гена нопалинсинтазы. Стрелками показаны рестрицирующие эндонуклеазы.

Рис. 2. Электрофореграмма продуктов ПЦР: ДНК растений рапса со специфичными к гену gfp праймерами.
М – маркер; С(+) – положительный контроль; С() – отрицательный контроль; W – дистиллированная вода; 18 – ДНК трансгенных растений рапса.

Рис. 3. Экспрессия гена gfp.
На ранней стадии: а – в срезе ризоидного образования; б – в срезе каллуса; в – в сосудистой ткани. В сформировавшемся растении: г – в старом листе; д – в молодом листе; е – в жилках листа; ж – в трихомах листа; з – в листовой пластинке; и – в устьицах листа; к – в стеблях; л – в главной жилке листьев.