УДК 581.1

ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫЕ СТРАТЕГИИ ПОВЫШЕНИЯ УСТОЙЧИВОСТИ ТОМАТА 

К ГРИБНЫМ И БАКТЕРИАЛЬНЫМ ПАТОГЕНАМ

© 2013 г. М. Р. Халилуев*, Г. В. Шпаковский**

* Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Российский государственный аграрный университет – 

МСХА им. К.А. Тимирязева, Москва

** Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва

Поступила в редакцию 24.01.2013 г.

Представлена классификация и проведен подробный обзор известных в настоящее время эффективных стратегий повышения устойчивости растений томата (Solanum lycopersicum L., syn. Lycopersicon esculentum Mill.) к инфекционным болезням грибной и бактериальной этиологии с помощью генно-инженерных подходов. Приведены современные данные о механизмах защитного действия гетерологичных генов на повышение устойчивости трансгенных растений томата к грибным и бактериальным патогенам.

 

----------------------------------------

Сокращения: АМП – антимикробные пептиды; БИПГ – белковые ингибиторы полигалактуроназ; СВЧ – реакция сверхчувствительности; СПУ – системная приобретенная устойчивость; 35SCaMV – конститутивный промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты; KLP – семейство ноттиноподобных пептидов; PR-белки – белки, синтезируемые в растительной клетке при атаке патогеном (от pathogenesis-related proteins); RIP – семейство рибосом-инактивирующих белков.

Адрес для корреспонденции: Шпаковский Георгий Вячеславович. 117997 Москва, ГСП-7, ул. Миклухо-Маклая, 16/10. Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, лаборатория механизмов генной экспрессии. Факс: +7(495) 335-71-03; электронная почта: gvs@ibch.ru

 Ключевые слова: Solanum lycopersicum (Lycopersicon esculentum) – генетическая трансформация – устойчивость – фитопатогены – PR-белки – антимикробные пептиды

 

ВВЕДЕНИЕ

Томат (Solanum lycopersicum L., syn. Lycopersicon esculentum Mill.) является одной из важнейших продовольственных культур, занимающих первое место среди продукции овощеводства, как по своему значению, так и по объему производства. По данным Продовольственной и сельскохозяйственной организации Объединенных Наций (FAO), мировой валовой сбор товарной продукции томата в 2010 г. составил более 145.8 млн. т, из которых на долю России приходилось около 1.4% (2 млн. т) при возделывании на площади 115.2 тыс. га [1]. Высокий спрос на томат обуславливает непрерывное совершенствование сортимента, что, в свою очередь, требует постоянного улучшения ряда хозяйственно ценных признаков. 

Средняя урожайность томата в России по-прежнему остается низкой и за период 2000–2010 гг. составляла 14.9 т/га [1]. Одной из главных причин, лимитирующих высокую продуктивность томата, является существенный ущерб, наносимый болезнями. У томата насчитывается около 40 наиболее распространенных инфекционных болезней, большая часть которых имеет грибную и бактериальную этиологию. В связи с этим, устойчивость к биотическим стрессам – одно из приоритетных требований, предъявляемых к современным сортам и гибридам томатов.

Несмотря на достигнутые успехи классической селекции в получении генотипов с повышенной устойчивостью к отдельным болезням, проблема комплексной устойчивости, а также устойчивости к наиболее опасным болезням до сих пор не решена [2]. Причинами тому служат генетическая сложность признака, постоянные эволюционные процессы, происходящие в системе “хозяин–патоген”, а также возникновение высоко устойчивых биотипов патогенов на фоне применения повышенных объемов химических средств защиты [3].

В последние десятилетия для повышения устойчивости растений (в том числе, томата) к биотическим стрессам все более широкое применение находят методы генетической инженерии. Этому способствовал прогресс в установлении молекулярной природы защитных механизмов, обеспечивший возможность разработки новых стратегий борьбы с заболеваниями в дополнение к существующим традиционным подходам. Применение трансгенных форм растений, устойчивых к биопатогенам, позволяет существенно повысить окупаемость сельскохозяйственного производства, резко сократить загрязнение окружающей среды пестицидами, а также, во многих случаях, реализовать потенциальную урожайность растений. В представленном обзоре обобщены и представлены с описанием механизма их действия различные генно-инженерные стратегии, которые в настоящее время успешно применяются для повышения устойчивости растений томата к болезням, вызываемым грибными и бактериальными патогенами. 

 

ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ, КОДИРУЮЩИХ РАСТИТЕЛЬНЫЕ PR-БЕЛКИ И АНТИМИКРОБНЫЕ ПЕПТИДЫ (АМП) 

Экспрессия генов гетерологичных растительных PR-белков (белков, синтезируемых в растительной клетке при атаке патогеном) и антимикробных пептидов (АМП) является наиболее часто используемой генно-инженерной стратегией повышения устойчивости томата к болезням грибной и бактериальной природы (табл. 1). Согласно современной классификации, по сходству аминокислотных последовательностей, биохимическим характеристикам, биологической активности и клеточной локализации различают 17 семейств PR-белков и 9 семейств АМП [28–31]. Все защитные белки и пептиды характеризуются сравнительно небольшим размером, являются положительно заряженными, содержат значительное количество остатков цистеина, стабилизирующих третичную структуру за счет образования дисульфидных связей, число которых в зависимости от вида составляет от 2 до 8 [28, 30]. В результате многочисленных исследований in vitro было установлено, что многие из защитных PR-белков и АМП уже в микромолярных концентрациях обладают высокой антибактериальной и/или антифунгальной активностью, сравнимой с применением химических препаратов. Некоторые из них не оказывают токсического воздействия на клетки животных и человека, что является важным аспектом в отношении биобезопасности трансгенных растений [29, 31].

Для создания трансгенных растений томата с повышенной устойчивостью к патогенным микроорганизмам одними из первых были использованы растительные гены гидролитических ферментов – β-1,3-глюканаз и хитиназ, выделенные, соответственно, в PR-2 и PR-3 семейства защитных белков. Мишенями для β-1,3-глюканазы и хитиназы являются, соответственно, β-1,3-глюкан и хитин, являющиеся основными компонентами клеточной стенки большинства грибных патогенов. Защитная функция гидролитических ферментов, главным образом, связана с их способностью разрушать клеточную стенку и, тем самым, тормозить дальнейший рост и распространение гифов по растительным тканям. Хитиназа может действовать также как лизоцим, гидролизуя пептидоглюканы клеточных стенок бактерий [32].

В исследовании Tabaeizadeh с соавт. [7] методом агробактериальной трансформации в геном культурного томата был введен ген кислой эндохитиназы (pcht28) из дикорастущего вида Solanum chilense (Dunal) Reiche. Растения, полученные в результате самоопыления первичных трансформантов, отличались повышенной устойчивостью к расам 1 и 2 Verticillium dahliae. Оценка в условиях защищенного грунта трансгенных растений поколения Т2 на устойчивость к расе 2 V. dahliae показала, что степень проявления симптомов болезни у гомозиготных линий была существенно меньше по сравнению с нетрансформированным контролем. 

Экспрессия β-1,3-глюканазы кукурузы (M-GLU) у двух тестируемых трансгенных линий томата способствовала снижению симптомов развития альтернариоза на 7, 14 и 21 сутки после инокуляции растений суспензией конидий грибного патогена Alternaria solani [6].

Повышение устойчивости томата к возбудителю фузариозного увядания было достигнуто за счет конститутивной экспрессии генов хитиназы риса (chi11) и эндохитиназы пшеницы (chi194) [8, 9]. В первом случае две трансгенные линии томата поколения Т1 характеризовались меньшей частотой инфицированных растений (соответственно 11 и 60%) по сравнению с нетрансформированным контролем (80%). Экспрессия гена эндохитиназы пшеницы под контролем промотора гена убиквитина кукурузы существенно повышала устойчивость к фузариозному увяданию у двух трансгенных линий томата (поражаемость Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici, соответственно, на уровне 2 и 3 баллов) по сравнению с восприимчивым диким типом (8 баллов). 

Рядом исследователей [10–12] продемонстрировано повышение устойчивости томата к фитопатогенам за счет экспрессии растительных хитин-связывающих белков, выделенных в PR-4 семейство, и гевеиноподобных АМП. Отличительной особенностью обеих этих групп защитных пептидов является высокое сродство к полисахаридной цепи хитина, представляющего собой β-1,4-подобный биополимер N-ацетилглюкозамина. Данное сродство обусловлено наличием N-терминального хитин-связывающего домена, имеющего сходство с аминокислотной последовательностью гевеина – белка, выделенного из млечного сока Hevea brasiliensis Müll. Arg. [33]. Антигрибная активность PR-4 белков и гевеиноподобных АМП в отношении различных патогенов продемонстрирована в условиях in vitro, однако механизм их действия в защитных реакциях до конца не выяснен. Предполагается, что PR-4 белки и гевеиноподобные АМП включаются в процесс связывания с хитином клеточной стенки, приводя к морфологическим изменениям гифов, например, аберрантному ветвлению и сильному укорачиванию [30, 31].

Установлено, что плоды трансгенных растений томата, экспрессирующих кДНК гевеина (HEV1), были менее восприимчивы к инфекции грибным патогеном Trichoderma hamatum [10]. Эффективность использования хитин-связывающих белков и гевеиноподобных АМП продемонстрирована и в случае повышения устойчивости растений томата к патогенам рода Phytophthora, в составе клеточной стенки которых не содержится хитин. Трансгенные растения томата, экспрессирующие кДНК гевеиноподобного хитин-связывающего белка Pn-AMP2 из Pharbitis nil L., характеризовались повышенной устойчивостью к Phytophthora capsici [11]. Продемонстрировано положительное влияние экспрессии генов хитин-связывающего белка из Amaranthus caudatus L. (ac) и гевеиноподобных АМП из Stellaria media L. (amp1, amp2) в трансгенных растениях томата на повышение их устойчивости к возбудителю фитофтороза. При инокуляции картофельным изолятом Phytophthora infestans сегментов листьев трансгенных растений томата было выделено три линии, экспрессирующие ген ас, три линии, экспрессирующие ген amp2, и одна линия, экспрессирующая ген amp1, достоверно отличающиеся повышенной устойчивостью по сравнению с нетрансформированным контролем [12]. 

Перспективным для повышения устойчивости растений томата к грибным патогенам оказалось использование тауматиноподобных белков, выделенных в семейство PR-5. Уникальной особенностью белков этого семейства является набор механизмов, посредством которых они осуществляют защитную функцию. В современной литературе обсуждается, по крайней мере, четыре таких механизма [29, 34]: 1) пермеабилизация клеточной стенки патогена; 2) наличие β-1,3-глюканазной активности; 3) ингибирование зеаматином α-амилазы насекомых и трипсина млекопитающих в условиях in vitro; 4) нарушение организации клеточной стенки патогена за счет действия осмотина.

Первоначально в тестах in vitro было продемонстрировано ингибирование роста грибных патогенов Сandida albicans и Trichoderma reesei зеаматиноподобным белком кукурузы (Zlp), выделенным из трансгенных растений томата [14]. В последующих исследованиях было достигнуто снижение чувствительности растений томата к A. solani за счет высокого уровня конститутивной экспрессии тауматиноподобного белка риса [15]. В исследовании Корнеевой с соавт. [16] интеграция в геном томата гена thau II, кодирующего нативный суперсладкий белок тауматин, обеспечивала существенную задержку проявления симптомов поражения фитофторозом у двух трансгенных линий. Также авторами продемонстрирована антибактериальная активность тауматина. Выделены трансгенные линии, существенно отличающиеся от контроля повышенной устойчивостью к возбудителю черной бактериальной пятнистости томата [17].

Анализ литературы свидетельствует, что среди различных представителей защитных белков и пептидов наиболее часто повышение устойчивости томата к патогенам достигалось за счет экспрессии растительных дефензинов. Установлено, что большинство из них обладают антифунгальной и бактерицидной активностью, однако до конца остается не выясненным механизм их защитного действия. Предполагается, что фунгицидное действие обусловлено способностью связываться с гликолипидами мембраны, выполняющими в данном случае роль рецепторов. Некоторые растительные дефензины способны индуцировать образование АФК и вызывать апоптоз клеток дрожжей, взаимодействовать с белками, участвующими в регуляции клеточного цикла, блокировать Сa2+- и Na+-каналы, а также воздействовать не только на мембранные структуры гифов гриба, но и на внутриклеточные мишени [33, 34]. Механизм действия растительных дефензинов на бактерии до сих пор не изучен.

Конститутивная экспрессия гена Rs-afp2 способствовала повышению устойчивости растений томата к широкому спектру грибных фитопатогенов. В исследовании Парашиной с соавт. [18] неочищенные белковые экстракты, выделенные из листьев трансгенных линий томата с максимальным уровнем экспрессии Rs-afp2, в большей степени проявляли ингибирующее действие на рост ряда патогенов (P. infestans, A. solani, Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani и V. dahliae) по сравнению с экстрактами из нетрансформированных растений. Кроме того, биотесты на изолированных листьях томата при инокуляции их спорами A. solani и Alternaria tenuis позволили выделить линии, у которых количество инфекционных пятен и их средняя площадь были достоверно меньше, чем у контрольного образца. Схожие результаты были продемонстрированы болгарскими исследователями в отношении увеличения устойчивости трансгенных растений томатов к F. oxysporum f. sp. lycopersici и Botrytis cinerea [19]. Как и в предыдущей работе, авторы отметили положительную корреляцию между уровнем экспрессии трансгена и степенью устойчивости. 

Интеграция в геном культурного томата гена cdef1 повышала устойчивость к ряду грибных патогенов (Fusarium sp., Colletotrichum gloeosporioides, Curvularia sp.) и оомицету Phytophthora infestans в тестах in vitro и in vivo [20]. 

Снижение восприимчивости томата к фузариозному увяданию было достигнуто за счет экспрессии гена дефензина (MsDef1), выделенного из люцерны посевной. У одной из трансгенных линий с подтвержденной интеграцией в геном единичной копии гена MsDef1 частота растений без симптомов проявления болезни составила 81.8% от общего числа, тогда как у контроля – 7%. У десяти других протестированных Т1-трансгенных линий соответствующее значение варьировало в пределах 33.3–75.0% [21]. 

Повышение устойчивости томата к фитопатогенам было достигнуто также за счет экспрессии других представителей PR-белков и АМП. Так, введение в геном томата основного PR-1 белка перца (CABPR1) способствовало увеличению устойчивости к оомицету P. сapsici [4]. Трансгенные растения томата с экспрессией в листьях и корнях гена тионина из Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. характеризовались меньшей восприимчивостью к возбудителям фузариозного и бактериального увядания по сравнению с контролем [24]. Конститутивная экспрессия неспецифических липид-переносящих белков LjAMP1 и LjAMP2 в трансгенных линиях томата обуславливала повышение устойчивости к альтернариозу, а также вертициллезному и бактериальному увяданию [25].

Установлено, что ноттиноподобные пептиды (KLP), выделенные из растения Mirabilis jalapa L. сем. Никтагиновые, обладают высокой фунгицидной активностью широкого спектра действия, а также бактерицидным действием в отношении некоторых грамположительных бактерий [37]. Повышение устойчивости растений томата к A. solani было достигнуто за счет конститутивной экспрессии гена Mj-AMP1 [6]. 

Сравнительно недавно из клубней картофеля выделили два антимикробных пептида (SN1, SN2) с уникальной аминокислотной последовательностью, которые впоследствии были выделены в отдельное семейство АМП – снекины [38]. Их отличительной особенностью является наличие в аминокислотной последовательности мотива, характерного для гемолитических ядов змей. Суперпродукция снекина SN2 в трансгенных растениях томата способствовала существенной задержке, а также снижению симптомов развития бактериального рака по сравнению с нетрансформированным контролем [27].

Повышение устойчивости растений томата к грибным и бактериальным патогенам было достигнуто при одновременной экспрессии нескольких генов различных PR-белков [5, 13, 22, 23]. Рядом исследователей показано синергичное действие разных PR-белков, повышающее устойчивость трансгенных растений к фузариозному и бактериальному увяданию, а также серой гнили [5, 22, 23].

 

ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ КАТИОННЫХ ПЕПТИДНЫХ АНТИБИОТИКОВ 

И ЗАЩИТНЫХ БЕЛКОВ ЖИВОТНОГО И ГРИБНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

Для передачи растениям томата устойчивости к микроорганизмам оказалось перспективным использование различных генов катионных пептидных антибиотиков животного происхождения. В исследовании Alan с соавт. [39] методом агробактериальной трансформации получены растения томата с геном синтетического аналога магаинина II (MSI-99) – АМП, выделенного из кожи африканской шпорцевой лягушки (Xenopus laevis). По результатам тестирования этих растений на устойчивость к Pseudomonas syringae pv. tomato установлено, что степень проявления симптомов развития болезни у некоторых линий была значительно меньше, чем у контрольного образца. Однако они оказались восприимчивы к A. solani и P. infestans. 

Векторная конструкция pBI121-spCB, в составе Т-ДНК которой содержится природный ген цекропина В, выделенный из шелкопряда (Hyalophora cecropia), с сигнальной последовательностью гена α-амилазы ячменя, была использована для получения трансгенных растений томата, устойчивых к бактериальному увяданию. Кроме того, количество бактериальных пятен, вызванных Xanthomonas campestris pv. vesicatoria, на листьях трансгенных растений было на 74% ниже по сравнению с контролем [40].

Значительная устойчивость растений томата к бактериальному увяданию была также достигнута за счет экспрессии гена лактоферрина (LF). Лактоферрин – мультифункциональный железо-связывающий гликопротеин с мол. м. 80 кД, который проявляет антибактериальную активность по отношению к грамположительным и грамотрицательным бактериям, обладает фунгицидным действием, а также играет ключевую роль в модуляции иммунного ответа у млекопитающих [41]. Экспрессия лактоферрина человека в трансгенных растениях томата обеспечивала существенную задержку развития Ralstonia solanacearum. По сравнению с нетрансформированными контрольными растениями, которые погибали через 26 дней после заражения патогеном, около половины тестируемых растений двух трансгенных линий (соответственно, 44 и 55%) выживали до стадии созревания плодов [42]. 

Как и в случае растительных PR-белков и АМП, эффективной стратегией повышения устойчивости растений томата к болезням является использование защитных дефензинов и хитиназ животного и грибного происхождения. Показано, что экспрессия в растениях томата короткого α-дефензина (33 аминокислотных остатка), выделенного из нейтрофилов кролика, повышала устойчивость к фузариозному увяданию в тестах in vitro и in vivo [43]. Неочищенные белковые экстракты из листьев томата трансгенных линий с высоким уровнем экспрессии эндохитиназы гриба Trichoderma virens ингибировали рост патогена Sclerotinia sclerotiorum в тесте in vitro. Кроме того, при инокуляции отделенных листьев Alternaria alternata было установлено, что площадь инфекционного пятна у трансгенных линий была в 1.9–3.4 раза меньше, чем у контрольных растений [44]. 

 

МЕТАБОЛИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ ФИТОАЛЕКСИНОВ И ГОРМОНОВ

Для придания устойчивости томата к фитопатогенам большой интерес представляет стратегия метаболической инженерии с использованием генов, кодирующих фитоалексины – защитные низкомолекулярные соединения, индуцируемые при воздействии патогенных микроорганизмов и элиситоров [45]. В исследовании Thomzik с соавт. [46] в растения томата сорта Vollendung были перенесены два гена стилбенсинтазы винограда. Полученные растения синтезировали фитоалексин резвератрол, олигомерная форма которого (винеферин) является токсичной для ряда фитопатогенов. Стилбенсинтаза катализирует реакцию синтеза резвератрола из трех молекул малонил-CoA и одной молекулы 4-кумарил-CoA-соединений, присутствующих в клетках любых растений. Экспрессия стилбенсинтазы способствовала существенному снижению чувствительности растений к P. infestans. Однако накопление резвератрола не индуцировало повышение устойчивости к B. cinerea и A. solani. В то же время, как было показано в работе [47], устойчивость растений к неспецифическому патогену пасленовых – B. cynerea – можно существенно повысить путем экспрессии в них кДНК СYP11A1, кодирующей цитохром P450SCC (CYP11A1) – ключевой фермент стероидогенеза, уникальный для животных. Авторами показано, что продукция в трансгенных растениях цитохрома P450SCC приводит к синтезу в них прегненолона (общего предшественника всех стероидных гормонов животных) и прогестерона, содержание которого в трансгенных растениях по сравнению с растениями дикого типа повышается в несколько раз [48]. По мнению авторов, именно эндогенный прогестерон, участвующий в регуляции вегетативного и генеративного развития растений, обуславливает повышенную устойчивость полученных трансгенных растений сем. Solanaceae к биотическому стрессу.

 

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ГЕНОВ УСТОЙЧИВОСТИ (R-ГЕНОВ)

В целях повышения устойчивости растений к фитопатогенам особое внимание привлекает использование генов, ответственных за узнавание патогена и трансдукцию сигнала узнавания (R-генов) согласно стратегии “ген на ген” [49]. Эта стратегия получила широкое распространение в селекционных программах многих сельскохозяйственных культур преимущественно благодаря приобретению растением полной резистентности к конкретному патогену. Однако существенным ее недостатком является исключительная расовая специфичность. Устойчивость растений достигается благодаря развитию некроза в месте поражения, в результате чего инфекция не получает дальнейшего распространения. Для индукции некроза необходимо наличие двух дополняющих друг друга генов: гена сигнального пептида у патогена и гена соответствующего рецептора у растения. Взаимодействие этих двух компонентов является пусковым механизмом для индукции реакции сверхчувствительности (СВЧ) [50]. 

К настоящему времени охарактеризована бόльшая часть известных R-генов, выделенных как из культурного, так и диких видов томата. Благодаря установленной молекулярной структуре и изученным биохимическим функциям кодируемых белков, R-гены томата были разделены на четыре класса: TNL, CNL, RPL и смешанный [51, 52] (табл. 2).

Ген Bs4, обеспечивающий устойчивость растений томата к X. campestris, кодирует белки, которые содержат TIR-домен (домен, имеющий гомологию с цитоплазматическим доменом Toll-белка дрозофилы и рецептором интерлейкина-1 млекопитающих, состоящий из трех консервативных районов и обеспечивающий белок–белковое взаимодействие), нуклеотид-связывающий участок (NBS-домен) и область лейцин-богатых повторов (LRR-домен). 

Ко второму классу относятся гены, кодирующие белки, в составе которых присутствует не TIR-домен, а спирально-скрученный домен (СС), а также NBS- и LRR-домены. Представителями данного класса являются гены, обуславливающие устойчивость томата к P. syringae (Prf) и F. oxysporum (I). Белки, кодируемые генами перечисленных двух классов, обладают только внутриклеточной локализацией, тогда как рецептор-подобные белки (RLP) являются трансмембранными и характеризуются как внеклеточной, так и цитоплазматической локализацией. Примером R-генов томата, кодирующих RLP, являются гены Сf и Ve.

В отдельную группу выделены R-гены томата, продукты которых, согласно вышеупомянутым структурным и функциональным особенностям, до настоящего времени не могут быть отнесены к какому-либо из перечисленных классов. Примерами таких генов является ген Pto, который кодирует белок, не содержащий области лейцин-богатых повторов, присутствующей у представителей трех других классов, а также гены Asc-1 и Ol.

Хорошо изученной моделью взаимодействия “растение–патоген” являются томат и патоген Cladosporium fulvum. В исследовании Honee с соавт. [53] получены трансгенные растения томата, содержащие ген авирулентности AVR9 C. fulvum. При скрещивании трансгенных линий томата с образцами дикого типа, содержащими ген резистентности Cf-9, было отмечено наличие в потомстве растений с карликовым фенотипом, у которых происходила некротизация и, как следствие, отмирание листьев. Данные генетического анализа свидетельствовали о присутствии у гибридов обоих генов AVR9 и Cf-9 в активном состоянии, а экспрессия соответствующих белковых продуктов способствовала запуску реакции СВЧ без инвазии патогеном.

Другим примером R-гена, выполняющего функцию трансдукции сигнала, является ген Pto, выделенный из дикого вида томата S. pimpinellifolium L. Ген Pto кодирует сериновую и/или треониновую протеинкиназу и обуславливает устойчивость растений к бактериальным штаммам P. syringae pv. tomato, экспрессирующим ген авирулентности avrPto. Перенос кДНК гена Pto под контролем сильного конститутивного промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты (35SCaMV) в восприимчивые сорта томата Moneymarker [54] и Urfa-2 [55] способствовал развитию устойчивости к бактериальной точечности плодов.

Аналогичным образом R-гены перца (Bs2) и риса (Xa21) успешно использовали для придания растениям томата устойчивости к возбудителю черной бактериальной пятнистости [56, 57]. Полученные результаты свидетельствуют о существенной структурной и функциональной консервативности компонентов сигнальных путей и механизмов устойчивости к фитопатогенам у растений одного семейства и дают основание предполагать существование определенной структурно-функциональной гомологии даже у растений более широкого таксономического круга. 

 

ИНГИБИРОВАНИЕ ТОКСИЧНЫХ ПРОДУКТОВ ПАТОГЕНА

Проникновение в ткани растений фитопатогенных грибов осуществляется за счет секретируемых полигалактуроназ, осуществляющих расщепление пектиновых соединений клеточной стенки. При изучении патологического процесса внимание исследователей привлекло наличие в апопласте практически всех тканей и органов большинства изученных растений специфических соединений – белковых ингибиторов полигалактуроназ (БИПГ) [58]. Заражение, поранение и обработка некоторыми элиситорами стимулирует экспрессию генов БИПГ, однако присутствие БИПГ далеко не всегда обеспечивает устойчивость тканей к заболеваниям [59]. Так, высокий уровень экспрессии в трансгенных растениях томата гена PGIP-1, выделенного из Phaseolus vulgaris L., не оказывало влияния на увеличение устойчивости к F. oxysporum sp. lycopersici, B. cinerea и A. solani [60]. Однако экспрессия БИПГ из плодов груши (pPGIP) препятствовала снижению развития колоний B. сinerea на листьях и плодах трансгенных растений томата, соответственно, на 15 и 25% по сравнению с нетрансформированным контролем [61].

Секреция грибами токсичных метаболитов, например, щавелевой кислоты, способствует угнетению защитных функций клеток в месте атаки, а затем вызывает их гибель, облегчая тем самым колонизацию патогеном. Снижение симптомов проявления серой гнили у трансгенных растений томата было достигнуто за счет интеграции в геном гена пшеницы ОхО, кодирующего оксалатоксидазу, под контролем 35SCaMV промотора. Одна из тестируемых линий отличалась повышенной устойчивостью к S. sclerotiorum по сравнению с контрольным образцом [26]. Существенное снижение симптомов развития склеротиниоза у томата было также достигнуто за счет экспрессии гена оксалатдекарбоксилазы, выделенного из гриба Collybia velutipes [62]. Повышение устойчивости к вышеперечисленным патогенам обусловлено способностью данных ферментов утилизировать токсичный для растительной клетки метаболит гриба, а именно участвовать в реакции окисления щавелевой кислоты до H2O2 и СО2 (в случае оксалатоксидазы) и декарбоксилирования до муравьиной кислоты и СО2 (в случае оксалатдекарбоксилазы). 

 

ЛИГНИФИКАЦИЯ РАСТИТЕЛЬНОЙ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ

К числу важнейших биохимических процессов, проявляющихся как при механическом повреждении растительных тканей, так и в ходе развития ответных реакций на внедрение патогенов, относится лигнификация [63]. Это подтверждается скоплением лигниноподобного материала в местах проникновения гриба в растительную клетку. Несмотря на многочисленные сведения о накоплении лигнина в растительных тканях при патогенезе, механизмы регуляции этого процесса пока не ясны. Предполагается, что на поверхности клеточных стенок фитопатогена имеются соединения, способные привлекать растительные ферменты, участвующие в биосинтезе лигнина. Также существует мнение, что важную роль в регуляции этих процессов выполняют фитогормоны [64].

Ферментом, активно включающимся в процесс лигнификации, является пероксидаза. Ее активность многократно увеличивается в тканях, инфицированных фитопатогенами. В особенности такое свойство характерно для форм изопероксидаз, связанных с клеточной стенкой [65]. В литературе приводятся сведения о способности пероксидазы эффективно включаться в процессы межмолекулярного сшивания различных компонентов клеточной стенки растений, таких как целлюлоза, каллоза, ксиланы и пектины [66].

Для томата рядом исследователей отмечена положительная корреляция между уровнем экспрессии пероксидазы, количеством лигнина и повышением устойчивости к патогенам [67, 68]. В исследовании Lagrimini с соавт. [69] экспрессия в растениях томата анионной пероксидазы табака (TobAnPOD) приводила к увеличению количества синтезируемого лигнина в листьях и плодах, однако это не повлияло на увеличение устойчивости к возбудителю фузариозного (F. oxysporum) и вертициллезного (V. dahlia) увядания. 

 

АКТИВАЦИЯ ЗАЩИТНЫХ РЕАКЦИЙ РАСТЕНИЯ

Действие патогена на растительный организм вызывает значительные изменения метаболизма растений. Активаторами защитных реакций растений могут являться элиситоры патогенов, а также сигнальные молекулы, например, этилен, салициловая и жасмоновая кислоты, которые выступают в качестве индукторов для запуска синтеза PR-белков, АМП, фитоалексинов и развития реакции СВЧ и системной приобретенной устойчивости (СПУ) [30, 31, 70]. 

В исследовании Oldroyd с соавт. [71] продемонстрировано, что экспрессия в трансгенных растениях томата R-гена Prf способствовала 2–3-кратному увеличению количества салициловой кислоты по сравнению с диким типом, а также индуцировала синтез PR-белков и формирование СПУ. Авторами отмечено, что даже низкий уровень экспрессии гена Prf был достаточен для развития СПУ, но не для реакции СВЧ. Индукция СПУ обуславливала существенное повышение устойчивости томата к широкому кругу бактериальных патогенов (P. syringae pv. tomato, X. campestris pv. vesicatoria и R. solanacearum), а также к вирусу мозаики томата. 

Развитию СПУ у томата способствовала экспрессия гена NPR1 A. thaliana (L.) Heynh., который кодирует белок, содержащий анкириновые повторы. Продукт гена NPR1 локализуется в ядре и играет важную роль в регуляции экспрессии генов, индуцируемых в ответ на заражение патогенами. Показано, что анкириновые повторы необходимы для связывания NPR1 с факторами транскрипции семейства TGA (bZIP), содержащими домен “лейциновая молния” [72]. Трансгенные растения томата, экспрессирующие NPR1, характеризовались высокой устойчивостью к фузариозному и бактериальному увяданию, а также умеренной устойчивостью к бактериальной пятнистости и серой пятнистости листьев [73]. 

Снижению восприимчивости томата к возбудителю бактериальной точечности плодов способствовала конститутивная экспрессия генов Pti5 и Pti5-VP16, кодирующих патоген-индуцибельный транскрипционный фактор EREBP (от ethylene response element-binding protein-like transcription factor), который, в свою очередь, взаимодействует с продуктами R-гена Pto [74]. 

В настоящее время установлено, что основным системным сигналом при поранении и проникновении патогенов в растение является системин – обогащенный пролином короткий пептид, содержащий 18 аминокислотных остатков. Впервые он был обнаружен у растений томата и впоследствии выделен и охарактеризован лишь у некоторых видов сем. Solanaceae. Установлено, что локальное поранение приводит к образованию системина из 200-аминокислотного предшественника (просистемина). Впоследствии этот пептид связывается на мембранах клеток с рецептором SR160, который представляет собой протеинкиназу, обогащенную лейциновыми повторами. Системин индуцирует на участке поранения синтез жасмоновой кислоты, ингибиторов протеиназ и фитоалексинов [75]. В исследовании Jones с соавт. [76] были получены трансгенные растения томата с гибридным геном (potpro2-pep11), кодирующим просистемин картофеля с последовательностью АМП. В тесте на отделенных листьях при инокуляции их зооспорами P. infestans показано, что средняя площадь инфекционного пятна у трансгенных растений томата была на 50% меньше, чем у нетрансформированного контроля. 

Одной из наиболее ранних ответных реакций растительных клеток на заражение патогеном является так называемый “окислительный взрыв”, выражающийся в образовании АФК [77]. Суперпродукция в трансгенных растениях томата белка ферредоксина I перца (PFLP) – ключевого фермента ФС I, принимающего участие в транспорте электронов, способствовала генерации АФК, и, как следствие, снижению чувствительности к R. solanacearum и Erwinia carotovora subsp. carotovora [78]. 

Повышение устойчивости томата к возбудителю фитофтороза было достигнуто за счет экспрессии гена CaKR1, выделенного из листьев перца и кодирующего анкириновый повтор домена “цинковые пальцы”. По сравнению с контролем, у трансгенных растений томата наблюдался более низкий уровень АФК (супероксида, H2O2) и более высокий уровень транскриптов, кодирующих PR-белки (LePR1, LePR2, LePR3), а также такие антиоксидантные ферменты, как супероксиддисмутаза (LeSOD2) и аскорбатпероксидаза (LeAPX2 и LeAPX3) [79]. 

Установлено, что H2O2 оказывает непосредственное ингибирующее действие на рост ряда патогенов. Кроме того, она может служить вторичным мессенджером при активации генов, кодирующих PR-белки, а также способствовать индукции и накоплению салициловой кислоты, этилена и фитоалексинов [80]. Существенное увеличение количества H2O2 в растениях томата было получено за счет супрессии гена каталазы (TOMCAT1) антисмысловой РНК. В отличие от контроля, полученные трансгенные линии характеризовались усиленной экспрессией генов, кодирующих PR-белки, а также повышенной устойчивостью к возбудителю бактериальной точечности плодов [81]. Конститутивная экспрессия гена аскорбатпероксидазы Capsicum annum L. (CAOPA1) в растениях томата обеспечивала существенное снижение чувствительности к оомицету P. capsici [4]. 

Известно, что при инфекции патогенами в клетках растений возрастает содержание полифенолов и, соответственно, полифенолоксидазы – фермента класса оксидоредуктаз, катализирующего окисление о-дифенолов, а также моно-, три- и полифенолов с образованием соответствующих хинонов. Считается, что данный процесс является одним из способов обезвреживания токсичных продуктов обмена. Кроме того, окисленные фенолы токсичны для клеток патогенов, и также принимают участие в инактивации экзоферментов, синтезе фитоалексинов, образовании лигнина, суберина и генерировании АФК [82]. В исследовании Thipyapong с соавт. [83] супрессия полифенолоксидазы была достигнута за счет введения в геном томата кДНК полифенолоксидазы картофеля (PPO) в антисенс ориентации. По сравнению с контролем у трансгенных растений наблюдалось 40-кратное снижение уровня окисления кофеиновой кислоты (основного о-дифенольного агликона, накапливающегося в листьях томата) и существенное повышение чувствительности к возбудителю бактериальной точечности плодов томата. Напротив, экспрессия в растениях томата кДНК PPO под контролем 35SCaMV увеличивала количество полифенолоксидазы как на транскрипционном (в 30 раз), так и на трансляционном (в 5–10 раз) уровнях. При заражении контрольных и трансгенных растений томата поколения Т1 бактериальным патогеном P. syringae pv. tomato было отмечено, что у последних симптомы развития болезни были выражены слабее: площадь некротических пятен и численность бактериальных клеток на инфицированных листьях были, соответственно, в 15 и 100 раз меньше [84]. 

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Первые сообщения о получении трансгенных растений томата с повышенной устойчивостью к грибным и бактериальным патогенам были представлены двумя независимыми группами исследователей в 1995 г. [5, 10]. Устойчивость, подтвержденная в лабораторных условиях, была достигнута за счет экспрессии генов, кодирующих белки семейств PR-2, PR-3 и PR-4. Впоследствии схожие результаты были продемонстрированы в многочисленных экспериментах при введении в геном томата гетерологичных генов, кодирующих PR-белки и АМП растительного, животного и бактериального происхождения [4, 6–9, 11–27, 39–40, 42–44]. Кроме того, снижение чувствительности томата, доказанное как в тестах in vitro, так и в условиях защищенного грунта, было достигнуто при использовании других генно-инженерных подходов: экспрессии R-генов, продукции гормонов и фитоалексинов, ингибировании токсичных продуктов патогена, а также активации защитных реакций растения. 

Известно, что полевые испытания трансгенных растений томатов с повышенной устойчивостью к грибным и бактериальным болезням проводились в различных странах. Так, в 3 из 77 полевых испытаний трансгенных растений, проведенных в странах Европейского Союза в период с 1992 по 2011 гг. (2 – в Нидерландах и 1 – в Италии), растения томата оценивали на устойчивость к заболеваниям, вызываемым грибными патогенами [85]. Однако, насколько нам известно, к настоящему времени нет сведений о получении трансгенных растений томата, устойчивых к грибным и бактериальным болезням и пригодных для коммерческого использования. Сложность получения таких растений, прежде всего, объясняется генетической сложностью и многогранностью этого признака, а также быстрой потерей растениями устойчивости. По крайней мере, частичное преодоление этих проблем может быть достигнуто путем встраивания в растительный геном сразу нескольких генов, относящихся к различным семействам, белковые продукты которых (например, PR-белки и АМП) обладают различными механизмами действия. Подобный подход был успешно продемонстрирован в ряде работ [5, 22, 23]. 

Помимо практической значимости, исследования по генетической трансформации растений томата с использованием защитных генов представляют и большую фундаментальную ценность для получения новых знаний о механизмах защитного действия различных белков и пептидов против фитопатогенов. Огромный интерес мирового научного сообщества в отношении такого нового направления физиологии растений, как физиология трансгенного растения, позволяет оптимистично оценивать возможный выход “генно-инженерных” растений томата, устойчивых к патогенам грибной и бактериальной природы, на промышленное производство.

 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Food and Agriculture Organization of the United Nations. Сайт Продовольственной и сельскохозяйственной организации Объединенных Наций [электронный ресурс]. Rome (Italy): FAO, 2012. http://www/fao.org

2. Смирнов А.Н., Кузнецов С.А. Фитофтороз томата // Защита и карантин растений. 2006. № 3. С. 20–23.

3. Смирнов А.Н. Ооспоры Phytophthora infestans // Микология и фитопатология. 2003. Т. 37. С. 3–21.

4. Sarowar S., Kim Y.J., Kim E.N., Kim K.D., Choi J.Y., Hyung N.I., Shin J.S. Constitutive expression of two pathogenesis-related genes in tomato plants enhanced resistance to oomycete pathogen Phytophthora capsici // Plant Cell, Tissue Organ Cult. 2006. V. 86. P. 7–14.

5. Jongedijk E., Tigelaar H., van Roekel J.S.C., Bres-Vloemans S.A., Dekker I., van den Elsen P.J.M., Cornelissen B.J.C., Melchers L.S. Synergistic activity of chitinases and β-1,3-glucanases enhances fungal resistance in transgenic tomato plants // Euphytica. 1995. V. 85. P. 173–180.

6. Schaefer S.C., Gasic K., Cammue B., Broekaert W., van Damme E.J.M., Peumans W.J., Korban S.S. Enhanced resistance to early blight in transgenic tomato lines expressing heterologous plant defense genes // Planta. 2005. V. 222. P. 858–866.

7. Tabaeizadeh Z., Agharbaouri Z., Harrak H., Poysa V. Transgenic tomato plants expressing a Lycopersicon chilense chitinase gene demonstrate improved resistance to Verticillium dahliae race 2 // Plant Cell Rep. 1999. V. 19. P. 197–202.

8. Abbas D.E., Abdallah N.A., Madkour M.M. Production of transgenic tomato plants with enhanced resistance against the fungal pathogen Fusarium oxysporum // Arab. J. Biotechnol. 2009. V. 12. P. 73–84.

9. Girhepuje P.V., Shinde G.B. Transgenic tomato plant expressing a wheat endochitinase gene demonstrated enhanced resistance to Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici // Plant Cell, Tissue Organ Cult. 2010. V. 105. P. 243–251.

10. Lee H.-I., Raikhel N.V. Prohevein is poorly processed but show enhanced resistance to a chitin-binding fungus in transgenic plants // Braz. J. Med. Biol. Res. 1995. V. 28. P. 743–750.

11. Lee O.S., Lee B., Park N., Koo J.C., Kim Y.H., Prasad D.T., Karigar C., Chun H.J., Jeong B.R., Kim D.H., Nam J., Yun J.-G., Kwak S.-S., Cho M.J., Yun D.-J. Pn-AMPs, the hevein-like proteins from Pharbitis nil confers disease resistance against phytopathogenic fungi in tomato, Lycopersicum esculentum // Phytochemistry. 2003. V. 62. P. 1073–1079.

12. Халилуев М.Р., Мамонов А.Г., Смирнов А.Н., Харченко П.Н., Долгов С.В. Изучение экспрессии генов хитинсвязывающих белков и гевеин-подобных антимикробных пептидов в отношении повышения устойчивости растений томата к Phytophthora infestans // Докл. РАСХН. 2011. № 4. С. 22–27.

13. Ouyang B., Chen Y.H., Li H.X., Qian C.J., Huang S.L., Ye Z.B. Transformation of tomatoes with osmotin and chitinase genes and their resistance to Fusarium wilt // J. Hortic. Sci. Biotechnol. 2005. V. 80. P. 517–522.

14. Malehorn D.E., Borgmeyer J.R., Smith C.E., Shah D.M. Characterization and expression of an antifungal zeamatin-like protein (Zlp) gene from Zea mays // Plant Physiol. 1994. V. 106. P. 1471–1481.

15. Radhajeyalakshmi R., Velazhahan R., Balasubramanian P., Doraiswamy S. Overexpression of thaumatin-like protein in transgenic tomato plants confers enhanced resistance to Alternaria solani // Arch. Phytopathol. Plant Protect. 2005. V. 38. P. 257–266.

16. Korneeva I.V., Shestibratov K.A., Lavrova N.V., Firsov A.P., Lebedev V.G., Kharchenko P.N., Dolgov S.V. Expression of PR-5 Protein thaumatin II for Improving Diseases Resistance and Fruit Quality of Tomato // Acta Hortic. 2008. V. 789. P. 151–158. 

17. Korneeva I.V., Varlamova N.V., Pushin A.S., Firsov A.P., Dolgov S.V., Monakhos G.F., Motamedi Shalamzari A., Dzhalilov F.S. Transgenic tomato plants expressing PR-5 protein genes demonstrated resistance against Phytophthora infestans and Xanthomonas vesicatoria // Acta Hortic. 2011. V. 914. P. 415–418.

18. Парашина Е.В., Сердобинский Л.А., Калле Е.Г., Лаврова Н.В., Аветисов В.А., Лунин В.Г., Народицкий Б.С. Получение трансгенных растений рапса и томата, экспрессирующих ген дефензина редьки // Физиология растений. 2000. Т. 47. С. 471–478.

19. Kostov K., Christova P., Slavov S., Batchvarova R. Constitutive expression of a radish gene Rs-afp2 in tomato increased the resistance to fungal pathogen // Articles Agric. Environ. Biotechnol. 2009. V. 23. P. 1121–1125.

20. Zainal Z., Marouf E., Ismail I., Fei C.K. Expression of the Capsicum annum (Chili) defensin gene transgenic tomatoes confers enhanced resistance to fungal pathogen // Am. J. Plant Physiol. 2009. V. 4. P. 70–79.

21. Abdallah N.A., Shah D., Abbas D., Madkour M. Stable integration and expression of a plant defensin in tomato confers resistance to Fusarium wilt // GM Crops. 2010. V. 1. P. 344–350.

22. Чен С.Ч., Лиу А.Р., Чжоу Ц.Р. Экспрессия генов глюканазы и дефензина в трансгенных томатах приводит к повышенной устойчивости к Ralstonia solanacearum // Физиология растений. 2006. Т. 53. С. 756–763.

23. Chen S.C., Liu A.R., Wang F.H., Ahammed G.J. Combined overexpression of chitinase and defensin genes in transgenic tomato enhances resistance to Botrytis cinerea // Afr. J. Biotechnol. 2009. V. 8. P. 5182–5188.

24. Chan Y.-L., Prasad V., Chen K.H., Liu P.C., Chan M.-T., Cheng C.-P. Transgenic tomato plants expressing an Arabidopsis thionin (Thi2.1) driven by fruit-inactive promoter battle against phytopathogenic attack // Planta. 2005. V. 221. P. 386–393.

25. Li X., Yang X., Li D., Guo S., Pei Y. Enhanced disease resistance in transgenic tomato over-expression antimicrobial proteins LjAMP1 and LjAMP2 from motherwort seeds // Acta Phytophyl. Sinica. 2007. V. 4. P. 353–358.

26. Walz A., Zingen-Sell I., Loeffler M., Sauer M. Expression of an oxalate oxidase gene in tomato and severity of disease caused by Botrytis cinerea and Sclerotinia sclerotiorum // Plant Pathol. 2008. V. 57. P. 453–458.

27. Balaji V., Smart C.D. Over-expression of snakin-2 and extensin-like protein genes restricts pathogen invasiveness and enhanced tolerance to Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis in transgenic tomato (Solanum lycopersicum) // Transgenic Res. 2012. V. 21. P. 23–37.

28. Broekaert W.F., Cammue B.P.A., de Bolle M.F.C., Thevissen K., de Samblanx G.W., Osborn R.W., Nielson D.K. Antimicrobial peptides from plants // Crit. Rev. Plant Sci. 1997. V. 16. P. 297–323.

29. Selitrennikoff C.P. Antifungal proteins // Appl. Environ. Microbiol. 2001. V. 67. P. 2883–2894.

30. Edreva A. Pathogenesis-related protein: research progress in the last 15 years // Gen. Appl. Plant Physiol. 2005. V. 31. P. 105–124.

31. Van Loon L.C., Rep M., Pieterse C.M.J. Significance of inducible defense-related proteins in infected plants // Annu. Rev. Phytopathol. 2006. V. 44. P. 135–162.

32. Mauch F., Staehelin L.A. Functional implications of the subcellular localization of ethylene-induced chitinase and ß-1,3-glucanase in bean leaves // Plant Cell. 1989. V. 1. P. 447–457.

33. Van Parijs J., Broeckaert W.F., Goldstein I.J., Peumans W.J. Hevein: an antifungal protein from rubber-tree latex // Planta. 1991. V. 183. P. 258–264.

34. Liu J.-J., Sturrock R., Ekramoddoullah A.K.M. The Superfamily of thaumatin-like proteins: its origin, evolution, and expression towards biological function // Plant Cell Rep. 2009. V. 5. P. 419–436.

35. Thevissen K., Ghazi A., de SamblanxG.W., Brownlee C., Osborn R.W., Broekaert W.F. Fungal membrane responses induced by plant defensins and thionins // J. Biol. Chem. 1996. V. 27. P. 15 018–15 025.

36. Егоров Ц.А., Одинцова Т.И. Защитные пептиды иммунитета растений // Биоорганическая химия. 2012. Т. 38. С. 7–17.

37. Cammue B.P.A., de Bolle M.F.C., Terras F.R.G., Proost P., van Damme J., Rees S.B., Vanderleyden J., Broekaert W.F. Isolation and characterization of a novel class of plant antimicrobial peptides from Mirabilis jalapa L. seeds // J. Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 2228–2233.

38. Berrocal-Lobo M., Segura A., Moreno M., Lopez G., Garcia-Olmedo F., Molina A. Snakin-2, an antimicrobial peptide from potato whose gene is locally induced by wounding and responds to pathogen infection // Plant Physiol. 2002. V. 128. P. 951–961.

39. Alan A.R., Blowers A., Earle E.D. Expression of a magainin-type antimicrobial peptide gene (MSI-99) in tomato enhances resistance to bacterial speck disease // Plant Cell Rep. 2004. V. 22. P. 388–396.

40. Jan P.-S., Huang H.-Y., Chen H.-M. Expression of a synthesized gene encoding cationic peptide cecropin B in transgenic tomato plants protects against bacterial diseases // Appl. Environ. Microbiol. 2010. V. 76. P. 769–775.

41. Lönnerdal B., Iyer S. Lactoferrin: molecular structure and biological function // Annu. Rev. Nutr. 1995. V. 15. P. 93–110.

42. Lee T.-J., Coyne D.P., Clemente T.E., Mitra A. Partial resistance to bacterial wilt in transgenic tomato plants expressing antibacterial lactoferrin gene // J. Am. Soc. Hortic. Sci. 2002. V. 127. P. 158–164.

43. Zhang X.H., Guo D.J., Zhang L.M., Li W.B., Sun Y.R. The research on expression of rabbit defensin (NP-1) gene in transgenic tomato // Acta Genetica Sinica. 2000. V. 27. P. 953–958.

44. Shah M.R., Mukherjee P.K., Eapen S. Expression of a fungal endochitinase gene in transgenic tomato and tobacco results in enhanced tolerance to fungal pathogens // Physiol. Mol. Biol. Plants. 2010. V. 16. P. 39–51.

45. Grayer R.J., Kokubun T. Plant-fungal interactions: the search for phytoalexins and other antifungal compounds from higher plants // Phytochemistry. 2001. V. 56. P. 253–263.

46. Thomzik J.E., Stenzel K., Stöcker R., Schreier P.H., Hain R., Stahl D.J. Synthesis of a grapevine phytoalexin in transgenic tomatoes (Lycopersicon esculentum Mill.) conditions resistance against Phytophthora infestans // Physiol. Mol. Plant Pathol. 1997. V. 51. P. 265–278.

47. Картель Н.А., Шпаковский Г.В., Спивак С.Г., Бричкова Г.Г., Ярмолинский Д.Г., Бердичевец И.Н., Манешина Т.В. Рекомбинантная плазмида pGBP450f для получения трансгенных растений и способ получения трансгенных растений с повышенной продуктивностью и устойчивостью к грибным фитопатогенам: Патент № 2237717 (РФ) // Б.И. 2004. № 10.

48. Спивак С.Г., Бердичевец И.Н., Литвиновская Р.П., Драч С.В., Картель Н.А., Шпаковский Г.В. Некоторые особенности метаболизма стероидов в трансгенных растениях табака Nicotiana tabacum, несущих кДНК СYP11A1 цитохрома P450SCC из коры надпочечников быка // Биоорганическая химия. 2010. Т. 36. С. 241-250.

49. Flor H.H. Host–parasite interactions in flax rust – its genetics and other implications // Phytopathology. 1955. V. 45. P. 680–685.

50. Toyoda K., Collins N.C., Takahashi A., Shirasu K. Resistance and susceptibility of plants to fungal patogenes // Transgenic Res. 2002. V. 11. P. 567–582.

51. Van Ooijen G., van den Burg H.A., Cornelissen B.J.C., Takken F.L.W. Structure and function of resistance proteins in solanaceous plants // Annu. Rev. Phytopathol. 2007. V. 45. P. 43–72.

52. Liu J., Liu X., Dai L., Wang G. Recent progress in elucidating the structure, function and evolution of disease resistance genes in plants // J. Genet. Genom. 2007. V. 34. P 765–776.

53. Honee G., Melchers L.S., Vleeshouwers V.G.A.A., van Roekel J.S.C., de Wit P.J.G.M. Production of the AVR9 elicitor from the fungal pathogen Cladosporium fulfum in transgenic tobacco and tomato plants // Plant Mol. Biol. 1995. V. 29. P. 909–920.

54. Martin G.B., Brommonschenkel S.H., Chunwongse J., Frary A., Ganal M.W., Spivey R., Wu T., Earle E.D., Tanksley S.D. Map-based cloning of a protein kinase gene conferring disease resistance in tomato // Science. 1993. V. 262. P. 1432–1436.

55. Кок Н.К., Кайим М., Етизир Х., Сари Н., Унлу Юсир С., Арици С.Е. Повышение устойчивости трансгенных томатов к возбудителю бактериальной точечности плодов методом трансформации с использованием Agrobacterium tumefaciens // Физиология растений. 2007. Т. 54. С. 102–110.

56. Tai T.H., Dahlbeck D., Clark E.T., Gajiwala P., Pasion R., Whalen M.C., Stall R.E., Staskawicz B.J. Expression of the Bs2 pepper gene confers resistance to bacterial spot disease in tomato // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. P. 14 153–14 158.

57. Afroz A., Chaudhry Z., Rashid U., Ali G.M., Nazir F., Iqbal J., Khan M.R. Enhanced resistance against bacterial wilt in transgenic tomato (Lycopersicon esculentum) lines expressing the Xa21 gene // Plant Cell, Tissue Organ Cult. 2011. V. 104. P. 227–237.

58. De Lorenzo G., D'Ovidio R., Cervone F. The role of polygalacturonase-inhibiting proteins (PGIPs) in defense against pathogenic fungi // Annu. Rev. Phytopathol. 2001. V. 39. P. 313–335.

59. Глинка Е.М., Проценко М.А., Буланцева Е.А., Салькова Е.Г. Действие белкового ингибитора полигалактуроназы из тканей плодов яблони на активность полигалактуроназы фитопатогенных грибов // Прикл. биохимия и микробиология. 2001. Т. 37. С. 607–611.

60. Desiderio A., Aracri B., Leckie F., Mattei B., Salvi G., Tigelaar H., van Roekel J.S.C., Baulcombe D.C., Melchers L.S., de Lorenzo G., Cervone F. Polygalacturonase-inhibiting proteins (PGIPs) with different specificities are expressed in Phaseolus vulgaris // Mol. Plant–Microbe Interact. 1997. V. 10. P. 852–860.

61. Powell A.L.T., van Kan J., Ten Have A., Visser J., Greve L.C., Bennett A.B., Labavitch L.M. Transgenic expression of pear PGIP in tomato limits fungal colonization // Mol. Plant–Microbe Interact. 2000. V. 13. P. 942–950.

62. Kesarwani M., Azam M., Natarajan K., Mehta A., Datta A. Oxalate Decarboxylase from Collybia velutipes: Molecular cloning and its overexpression to confer resistance to fungal infection in transgenic tobacco and tomato // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 7230–7238.

63. Максимов И.В., Черепанова Е.А., Хайруллин Р.М. “Хитин-специфичные” пероксидазы в растениях // Биохимия. 2003. Т. 68. С. 133–138. 

64. Peberdy J.F. Presidential address: fungi without coats-protoplast as tool for mycological research // Mycol. Res. 1989. V. 93. P. 1–20.

65. Medeghini Bonatti P., Lorenzini G., Baroni Fornasiero R., Nali C., Sgarbi E. Cytochemical detection of cell wall bound peroxidase in rust infected broad bean leaves // J. Phytopathol. 1994. V. 140. P. 319–325.

66. Bradley D.J., Kjellbom P., Lamb C.J. Elicitor- and wound-induced oxidative cross-linking of a proline-rich plant cell wall structural protein: a novel, rapid plant defense response // Cell. 1992. V. 70. P. 21–30.

67. De Leeuw G.T.N. Deposition of lignin, suberin and callose in relation to the restriction of infection by Botrytis cinerea in ghost spots of tomato fruits // J. Phytopathol. 1985. V. 112. P. 143–152.

68. Reuveni R., Ferreira J.F. The relationship between peroxidase activity and the resistance of tomatoes (Lycopersicum esculentum) to Verticillium dahlia // J. Phytopathol. 1985. V. 112. P 193–197.

69. Lagrimini L.M., Vaughn J., Erb W.A., Miller S.A. Peroxidase overproduction in tomato: wound-induced polyphenol deposition and disease resistance // HortScience. 1993. V. 28. P. 218–221.

70. McDowell J.M., Dangl J.L. Signal transduction in the plant immune response // Trends Biochem. Sci. 2000. V. 25. P. 79–82.

71. Oldroyd G.E.D., Staskawicz B.J. Genetically engineered broad-spectrum disease resistance in tomato // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. P. 10 300–10 305.

72. Zhou J.-M., Trifa Y., Silva H., Pontier D., Lam E., Shah J., Klessig D.F. NPR1 differentially interacts with members of the TGA/OBF family of transcription factors that bind an element of the PR-1 gene required for induction by salicylic acid // Mol. Plant–Microbe Interact. 2000. V. 13. P. 191–202.

73. Lin W.-C., Lu C.-F., Wu J.-W., Cheng M.-L., Lin Y.-M., Yang N.-S., Black L., Green S.K., Wang J.-F., Cheng C.-P. Transgenic tomato plants expressing the Arabidopsis NPR1 gene display enhanced resistance to a spectrum of fungal and bacterial diseases // Transgenic Res. 2004. V. 13. P. 567–581.

74. He P., Warren R.F., Zhao T., Shan L., Zhu L., Tang X., Zhou J.-M. Overexpression of Pti5 in tomato potentiates pathogen-induced defense gene expression and enhanced diseases resistance to Pseudomonas syringae pv. tomato // Mol. Plant–Microbe Interact. 2001. V. 14. P. 1453–1457.

75. Scheer J.M., Ryan C.A. The systemin receptor SR160 Lycopersicon peruvianum is a member of the LRR receptor kinase family // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. V. 99. P. 9585–9590.

76. Jones R.W., Ospina-Giraldo M., Clemente T. Prosystemin – antimicrobial-peptide fusion reduces tomato late blight lesion expansion // Mol. Breed. 2004. V. 14. P. 83–89.

77. Mehdy M.C. Active oxygen species in plant defense against pathogens // Plant Physiol. 1994. V. 105. P. 467–472.

78. Huang H.-E., Liu C.-A., Lee M.-J., Kuo C.-G., Chen H.-M., Ger M.-J., Tsai Y.-C., Chen Y.-R., Lin M.-K., Feng T.-Y. Resistance enhancement of transgenic tomato to bacterial pathogens by the heterologous expression of sweet pepper ferredoxin-I protein // Phytopathology. 2007. V. 97. P. 900–906.

79. Seong E.S., Cho H.S., Choi D., Joung Y.H., Lim C.K., Hur J.H., Wang M.-H. Tomato plants overexpressing CaKR1 enhanced tolerance to salt and oxidative stress // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007. V. 363. P. 983–988.

80. Wu G., Shortt B.J., Lawrence E.B., Leon J., Fitzsimmons K.C., Levine E.B., Raskin I., Shah D.M. Activation of host defense mechanisms by elevated production of H2O2 in transgenic plants // Plant Physiol. 1997. V. 115. P. 427–435.

81. Kerdnaimongkol K., Woodson W.R. Inhibition of catalase by antisense RNA increases susceptibility to oxidative stress and chilling injury in tomato plants // J. Am. Soc. Hortic. Sci. 1999. V. 124. P. 330–336.

82. Mayer А.M. Polyphenol oxidases in plants and fungi: going places? A review // Phytochemistry. 2006. V. 67. P. 2318–2331.

83. Thipyapong P., Hunt M.D., Steffens J.C. Antisense down-regulation of polyphenol oxidase results in enhanced disease susceptibility // Planta. 2004. V. 220. P. 105–107.

84. Li L., Steffens J.C. Overexpression of polyphenol oxidase in transgenic tomato plants results in enhanced bacterial disease resistance // Planta. 2002. V. 215. P. 239–247.

85. Groeneveld R.A., Ansink E., van de Wiel C.C.M., Wesseler J. Benefits and costs of biologically contained genetically modified tomatoes and eggplants in Italy and Spain // Sustainability. 2011. V. 3. P. 1265–1281.