УДК 581.1

ФИЗИОЛОГИЯ И АДАПТИВНОЕ ЗНАЧЕНИЕ ВТОРИЧНОГО КАРОТИНОГЕНЕЗА У ЗЕЛЕНЫХ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ

© 2013 г. А. Е. Соловченко

Биологический факультет Московского государственного университета

им. М.В. Ломоносова, Москва

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки 

Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Москва

Поступила в редакцию 14.04.2012 г.

 

Некоторые виды одноклеточных зеленых водорослей в неблагоприятных условиях накапливают высокие количества вторичных каротиноидов (ВКар), не участвующих в фотосинтезе и локализованных во внетилакоидных структурах. Такие водоросли культивируют в промышленных масштабах для получения каротиноидов, обладающих ценными фармакологическими свойствами. Обзор посвящен анализу последних экспериментальных данных о значении вторичного каротиногенеза для стресс-толерантности одноклеточных зеленых водорослей (Chlorophyta). Рассматриваются особенности биосинтеза ВКар, его индукции и регуляции при действии стрессоров различной природы, а также локализация ВКар в клетке и физиологические эффекты накопления высоких количеств этих пигментов. Особое внимание уделяется связи биосинтеза ВКар с индукцией биосинтеза нейтральных липидов при стрессе, а также роли активных форм кислорода как универсального индуктора и регулятора биосинтеза ВКар. Обсуждаются различные аспекты защитной функции ВКар в клетках микроводорослей.

---------------------------------------------------------

Сокращения: ВКар – вторичные каротиноиды; Кар - каротиноиды; ОС - олеосомы; ТАГ - триацилглицерины; ФСА – фотосинтетический аппарат; Хл – хлорофилл(ы).

Адрес для корреспонденции: Соловченко Алексей Евгеньевич. 119234 Москва, ГСП-1, Воробьевы горы, д. 1, корп. 12. Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет. Факс: +7 (495) 939-38-07; электронная почта: solovchenko@mail.bio.msu.ru

Ключевые слова: Haematococcus pluvialis – Dunaliella bardawil – астаксантин – β-каротин – зеленые водоросли – фотоадаптация – фотоповреждение – олеосомы

 

ВВЕДЕНИЕ

 

В последние годы наблюдается бурный рост интереса к каротиногенным микроводорослям. Таковыми называют одноклеточные водоросли, накапливающие, обычно под влиянием неблагоприятных условий, высокие (до 6% сухого веса в случае Haematococcus pluvialis [1], см. также [2-4] и табл. 1) количества вторичных каротиноидов (ВКар). В отличие от первичных или фотосинтетических каротиноидов (Кар), ассоциированных с мембранами тилакоидов и выполняющих у фотоавтотрофных организмов, включая зеленые микроводоросли (Chlorophyta), жизненно важные функции светосбора, защиты от фотоокислительного повреждения и поддержания структуры фотосинтетического аппарата (ФСА) [5], ВКар не участвуют в фотосинтезе и не связаны с ФСА. Функции ВКар у каротиногенных микроводорослей до настоящего времени остаются предметом оживленной дискуссии. В качестве основных функций постулируются экранирование избыточной ФАР [6-8], создание стока для избыточных фотоассимилятов [9], а также подавление образования и детоксикация уже образовавшихся активных форм кислорода (АФК) [10, 11].

Следует отметить, что среди микроводорослей накопление ВКар особенно характерно для видов-экстремофилов, например для обитающих на поверхностях антарктических ледников и высокогорных снежников “снежных водорослей”, таких как Chlorella nivalis. С массовым ростом этих микроорганизмов связаны такие природные явления, как “кровавый дождь” и “кровавый снег” [12, 13]. Доминирующее положение каротиногенных микроводорослей в экосистемах с экстремальными условиями обитания связывают с высокой устойчивостью к неблагоприятным условиями среды, одним из факторов которой является высокое содержание ВКар в клетках. Типичным примером могут служить представители рода Dunaliella, способные к накоплению высоких количеств β-каротина [12, 14].

Каротиноиды, в том числе ВКар микроводорослей, обладают ценными для человека свойствами. Они являются провитаминами и эффективными антиоксидантами [15], препятствуют возникновению и развитию возрастных дегенеративных, а также онкологических заболеваний [16]; их используют как добавки и красители в пищевой промышленности и аквакультуре [17]. В этой связи многие микроводоросли, продуцирующие ВКар (табл. 1), являются важными объектами фотобиотехнологии [18]. Несмотря на это обстоятельство, пути биосинтеза, факторы индукции и механизмы регуляция синтеза ВКар изучены в существенно меньшей степени, чем у первичных Кар [5, 19, 20], однако за последнее десятилетие было опубликовано множество экспериментальных работ, посвященных ВКар. Для отдельных биотехнологически важных видов микроводорослей (H. pluvialis, Dunaliella salina) либо веществ (таких как астаксантин и β-каротин) эти сведения систематизированы в виде обзоров [9, 18, 21], однако общая картина физиологии вторичного каротиногенеза у зеленых микроводорослей сформирована далеко не полностью.

Цель настоящего обзора - систематизировать сведения о факторах индукции, путях биосинтеза и физиологической роли ВКар у одноклеточных зеленых водорослей, уделив особое внимание связи метаболизма ВКар и липидов при стрессах, а также сопровождающим эти процессы изменениям оптических свойств клеток микроводорослей. 

 

РАЗНООБРАЗИЕ ВТОРИЧНЫХ КАРОТИНОИДОВ

 

По своему структурному разнообразию ВКар, встречающиеся у микроводорослей, превосходят первичные Кар [22]. По-видимому, это обстоятельство является следствием высокой консервативности ФСА: лишь молекулы Кар со строго определенными физико-химическими и фотофизическими свойствами могут включаться в состав пигмент-белковых комплексов фотосинтетических мембран и обеспечивать поглощение, миграцию и утилизацию энергии света [23]. Напротив, структура ВКар не детерминирована столь жестко и существенно варьирует у различных групп микроводорослей, многие из которых обладают специфическим набором ВКар. 

Нередко в качестве ВКар накапливаются молекулярные виды Кар, характерные для ФСА, такие как лютеин [24, 25] или β-каротин [18, 26]; распространены также ВКар, нехарактерные для пигмент-белковых комплексов ФСА. Так, конечным продуктом биосинтеза вторичных Кар у H. pluvialis и ряда других микроводорослей [27] является астаксантин, содержащий две кето- и две оксигруппы, либо (у Chlorella emersonii) кантаксантин [28]. На таксономической специфичности качественного состава ВКар базируется ряд методов хемосистематики и идентификации планктонных микроводорослей (см., например, [29]). Однако ВКар с экзотической, специфичной для определенных таксонов структурой (таковых насчитывается несколько сотен [22]) накапливаются, как правило, в небольших количествах и редко встречаются у зеленых микроводорослей. Некоторые каротиногенные представители Chlorophyta, включая наиболее изученные и биотехнологические важные, перечислены с указанием доминирующих ВКар в табл. 1.

 

ОСОБЕННОСТИ БИОСИНТЕЗА ВТОРИЧНЫХ КАРОТИНОИДОВ

 

Первые этапы - сборка углеродного скелета, десатурация, циклизация, гидроксилирование (а в случае β-каротина и лютеина - вcе этапы) биосинтеза вторичных и первичных Кар идентичны. Ниже дается их краткое описание (см. также рис. 1 и табл. 2), более подробное описание реакций, катализирующих их ферментов и соответствующих генов приводится в обзорах [19, 20], там же можно найти номенклатурные названия этих соединений. К сожалению, проанализировать результаты многочисленных работ, посвященных дифференциальной экспрессии генов биосинтеза ВКар при стрессах здесь не представляется возможными, поэтому ниже рассматриваются только ключевые стадии биосинтеза ВКар; подробнее об этом см. в обзоре Lemoine и Schoefs [9].

Сборка углеродного скелета. У зеленых микроводорослей, как и у высших растений, предшественником Кар является изопентенилпирофосфат (IPP), синтезируемый в глицеральдегидфосфат-пируватном или мевалонатном пути [20]. В обратимой реакции, катализируемой IPP-изомеразой, IPP превращается в свой аллильный изомер - диметилаллилпирофосфат (DMAPP), исходный активированный субстрат для синтеза полиизопреноидных цепей. Предполагается, что этот фермент, найденный и у каротиногенных микроводорослей, играет существенную роль в регуляции биосинтеза Кар, лимитируя поступление предшественников в этот путь [19]. Далее в результате трех последовательных реакций присоединения IPP к одной молекуле DMAPP образуется молекула геранилгеранилпирофосфата (GGPP, С20) с участием GGPP-синтазы. Из двух молекул GGPP образуется симметричная молекула фитоина в реакции, катализируемой фитоинсинтазой (PSY). 

Десатурация и циклизация. Молекула фитоина последовательно подвергается четырем реакциям десатурации, катализируемым фитоиндесатуразой (PDS) и ζ-каротиндесатуразой (ZDS), с образованием сначала фитофлюина, затем ζ-каротина, нейроспорина и ликопина. В результате удлинения системы сопряженных двойных связей бесцветные предшественники Кар превращаются в окрашенные (начиная с ζ-каротина) соединения [20]. Интересно, что у Dunaliella bardawil, накапливающей высокие количества β-каротина, не наблюдается индукции PSY или PDS на уровне транскрипции или трансляции [30], тогда как для H. pluvialis характерно обратное [31].

Предполагается, что ко-фактором десатураз у микроводорослей является пластидная терминальная оксидаза (PTOX), которая вносит существенный вклад в защиту клеток от окислительного стресса (см. ниже). Реакции десатурации также относят к лимитирующим этапам биосинтеза ВКар: предполагается, что при стрессе некоторый белковый фактор (factor X), кодируемый геномом хлоропластов, активирует ядерный ген pds1, стимулируя тем самым синтез предшественников β-каротина [9].

Связанный с мембраной фермент β-ликопинциклаза (CRTL-B) катализирует образование дициклических Кар из симметричной линейной молекулы ликопина. У ряда микроводорослей часто встречаются и Кар, включающие кольцо другого типа - ε-кольцо, которое отличается от β-кольца только расположением двойной связи. Так, лютеин, один из доминирующих Кар фотоавтотрофов, содержит одно β- и одно ε-кольцо. Каротиноиды с двумя ε-кольцами встречаются сравнительно редко. Несмотря на высокую степень гомологии с β-циклазой, ε-циклаза формирует только одно ε-кольцо с образованием моноциклического δ-каротина (ε, ψ-каротина). Считается, что циклазы также могут играть одну из ключевых ролей в регуляции образования циклических ВКар [19].

Оксигенирование. Путь биосинтеза оксигенированных ВКар довольно подробно изучен, многие связанные с ним гены выделены и клонированы [9, 32, 33]. В результате гидроксилирования в положении 3 колец α- и β-каротинов образуются зеаксантин и лютеин, соответственно; добавление кетогруппы в положении 4 к одному или к обоим кольцам приводит к образованию оранжево-красных кетокаротиноидов эхинеона и кантаксантина, предшественников астаксантина [31].

Реакция оксигенирования β-каротина катализируется β-C-4-оксигеназой (кетолазой, CRTO или BKT), кодируемой у H. pluvialis геном crtO или bkt ([31], табл. 2; у различных штаммов H. pluvialis имеется до трех генов bkt, кодирующих функционально близкие ферменты BKT1-BKT3 [9, 32, 33]). CRTO H. pluvialis относится к обширному семейству гидрофобных мембраносвязанных оксигеназ, содержащих два атома Fe, ее активность повышается в присутствии ионов Fe и молекулярного кислорода [33]. Этот фермент неспособен использовать диоксикаротиноид зеаксантин в качестве субстрата, следовательно, в процессе синтеза астаксантина добавление кетогрупп происходит перед гидроксилированием [32]. 

О важной роли CRTO в каротиногенезе свидетельствует и кинетика усиления активности этого фермента, сходная с кинетикой накопления ВКар. На начальных стадиях каротиногенеза количество белка CRTO увеличивается параллельно росту количества мРНК этого фермента (максимальное содержание транскрипта отмечается после 12-48 ч воздействия стрессора [9]), после чего дальнейшее увеличение количества фермента не сопровождается пропорциональным ростом количества мРНК. Это может свидетельствовать об участии в регуляции этого фермента не только посттранскрипционных, но и посттрансляционных механизмов [31].

Методами ингибиторного анализа и иммуноцитохимии установлено присутствие CRTO у H. pluvialis не только в хлоропласте, но и в цитоплазматических липидных глобулах - олеосомах (ОС [34]), в то время как синтез первичных Кар приурочен исключительно к пластидам [19]. Как отмечают Grьnewald с соавт. [34], молекулы CRTO выявляются не только на периферии ОС, но и внутри этих структур, что согласуется с гидрофобными свойствами этого фермента [33]. Действительно, CRTO активна в гидрофобных окружениях, таких как липидная среда ОС. Вероятно, в такой среде CRTO защищена от атаки протеаз, что может объяснять повышение активность этого фермента на фоне снижения содержания его мРНК. Следует также отметить, что, несмотря на присутствие CRTO внутри ОС, молекулы этого фермента активны только на поверхности ОС. По-видимому, это обстоятельство обусловлено потребностью в ко-факторах, поступающих из других компартментов, таких как эндоплазматический ретикулюм и аппарат Гольджи, что подтверждается ко-локализацией этих структур и ОС [35].

Таким образом, ОС у H. pluvialis не только выполняют функции липофильного депо для ВКар, но и участвуют в биосинтезе этих соединений, что не является типичным ни для высших растений, ни для микроводорослей. Так, у Dunaliella гранулы, накапливающие ВКар внутри пластид, сами по себе не обладают каротиногенной активностью [36]. 

Существенно, что фермент PDS, индукция которого также наблюдается у H. pluvialis при каротиногенезе, локализуется исключительно в хлоропласте [31]. Эти обстоятельства указывают на необходимость экспорта из хлоропласта данного вида микроводорослей β-каротина - предшественника, который подвергается впоследствии оксигенированию в ОС с образованием астаксантина, накапливающегося в этих структурах. Недавно присутствие β-каротина в ОС H. pluvialis, содержащих астаксантин было подтверждено in vivo методом рамановской спектроскопии [37], однако электронно-микроскопические исследования не выявили структур, связанных с транспортом β-каротина [38].

 

ИНДУКЦИЯ БИОСИНТЕЗА ВТОРИЧНЫХ КАРОТИНОИДОВ

 

Накопление ВКар наблюдается под влиянием различных стрессоров, в особенности комбинированных [9, 39, 40]. Примером может служить действие высоких потоков ФАР на фоне повышенной концентрации соли и других осмотиков в среде, дефицита азота и (или) фосфора. В некоторых случаях накопление ВКар, индуцированное неблагоприятными факторами, имеет характер дозо-зависимого эффекта [11, 14]. В целом, сдвиг баланса C/N в сторону углерода в данных условиях усиливает вторичный каротиногенез, однако механизмы индукции и регуляции биосинтеза ВКар при стрессах изучены недостаточно. 

Целый ряд исследователей указывает на участие АФК в индукции синтеза ВКар [10, 34, 41-45]. Добавление в среду соединений - генераторов АФК, таких как перекись водорода, пероксинитрит и гипохлорит натрия, вызывает накопление ВКар даже в темноте, имитируя действие стрессоров окружающей среды [46]. По всей видимости, АФК, образующиеся под действием света высокой интенсивности и (или) других стрессовых факторов, действуя как вторичные мессенджеры, опосредуют активацию вышеописанных путей биосинтеза Кар [17, 42, 45, 47]. По данным Fan [42], 1O2 наиболее эффективно индуцирует накопление астаксантина у H. pluvialis. Обработка клеток микроводорослей красителями-генераторами 1O2 (метиленовым синим и бенгальским розовым, 2 мкмоль) вызывает каротиногенез; напротив, добавление к среде тушителей 1О2 (гистидина или эозина, 25 ммоль) ингибирует каротиногенез [42]. Впрочем, нельзя исключать участие и других АФК (таких как супероксидный анион-радикал) в этом процессе [41]. Предполагается, что АФК либо продукты их метаболизма могут активировать предсинтезированные ферменты биосинтеза Кар либо индуцировать экспрессию кодирующих их генов, однако точный механизм его действия не известен (см. ссылки в работе [11]).

В целом, считается, что роль редокс-сенсора при регуляции синтеза как первичных, так и вторичных Кар играет пул пластохинона, в условиях стресса бульшую часть времени пребывающий в восстановленном состоянии [44]. Действительно, обработка ингибитором восстановления пластохинонового пула дихлордиметилмочевиной практически полностью ингибирует активацию генов биосинтеза Кар при действии света высокой интенсивности [44].

В одних случаях накопление ВКар (например, β-каротина у D. salina) невозможно без активации синтеза определенных белков [48], прежде всего ферментов биосинтеза Кар и белков, стабилизирующих липидные структуры, в которых накапливаются ВКар [43, 49]. Напротив, в других случаях (например, у H. pluvialis) индукция вторичного каротиногенеза протекает без заметной интенсификации синтеза белка, по-видимому, с участием предсинтезированных ферментов [11, 34]. Рассмотрим влияние отдельных факторов на динамику накопления ВКар микроводорослями более подробно.

Интенсивность и спектральный состав освещения. В литературе имеется множество свидетельств стимулирующего эффекта света высокой интенсивности в отношении биосинтеза ВКар у микроводорослей. В частности, Семененко с соавт. [48, 50] показали, что степень накопления β-каротина каротиногенными представителями рода Dunaliella прямо пропорциональна интегральной дозе облучения ФАР, полученной клетками микроводоросли на протяжении клеточного цикла. Сходные результаты были получены Ben-Amotz с соавт. [14]. В целом, стимулирующий эффект видимого света высокой интенсивности в случае каротиногенеза у Dunaliella не вызывает сомнений.

Данные о роли света в индукции синтеза астаксантина у H. pluvialis более противоречивы. Несмотря на большое количество фактов, подтверждающих стимулирующий эффект ФАР высокой интенсивности [1, 7, 11], давно известно, что эта микроводоросль способна накапливать астаксантин и в темноте в присутствии органического источника углерода (ацетата натрия) [51], а также соединений-генераторов АФК (см. выше). Следует отметить, что в неблагоприятных условиях, снижающих эффективность фиксации CO2 (например, при осмотическом или низкотемпературном стрессах), рост стационарной концентрации АФК наблюдается даже при относительно невысоких интенсивностях освещения [44]. Интересен тот факт, что добавление винбластина, задерживающего деление клеток H. pluvialis, вызывает индукцию каротиногенеза у этой микроводоросли даже в условиях, благоприятных для роста вегетативных клеток [21].

Влияние УФ на биосинтез ВКар у микроводорослей к настоящему моменту практически не изучено. Известно, что облучение УФ-А (но не УФ-B) в дополнение к ФАР также стимулирует массовое накопление β-каротина у Dunaliella [52, 53]. 

Дефицит минерального питания. Дефицит элементов минерального питания, прежде всего связанного азота и фосфора, также является фактором, стимулирующим накопление ВКар. Так, у культур H. pluvialis в условиях азотного и (или) фосфатного голодания наблюдается снижение скорости деления клеток, сопровождающееся потерей подвижности и повышением содержания астаксантина в расчете на клетку [21]. Выращивание. Parietochloris incisa на среде, не содержащей азота, приводило к усилению накопления β-каротина в ОС [40, 54]. Гербициды, ингибирующие глутаминсинтазу и нарушающие усвоение азота, индуцировали накопление астаксантина у H. pluvialis, подобно азотному голоданию [55].

Осмотический стресс. Установлено, что резкое повышение концентрации осмотически активных веществ в среде культивирования усиливает накопление Кар у каротиногенных микроводорослей обычно с некоторой задержкой. У D. salina в случае добавления NaCl длительность этой задержки зависит от исходной концентрации соли и степени ее повышения; величина индукции каротиногенеза определяется конечной концентрацией соли [56]. В этих условиях также отмечается снижение доли лютеина с одновременным снижением доли зеаксантина среди Кар, что свидетельствует о преимущественной активации у D. salina β-ликопинциклазы в условиях осмотического стресса, вызванного высокими концентрациями NaCl.

Температура. Субоптимальные температуры, особенно в сочетании с высокими потоками ФАР [48], также являются факторами индукции вторичного каротиногенеза. В частности, этот фактор вызывает интенсивное накопление β-каротина у D. salina [57]. По-видимому, низкие температуры важны и для индукции каротиногенеза у так называемых “снежных” водорослей [13].

Наличие органического источника углерода. Добавление органического источника углерода нередко усиливает накопление ВКар у каротиногенных микроводорослей, способных к гетеротрофному либо фотогетеротрофному росту. Подобные эффекты наблюдается у Trentepohlia aurea при добавлении в среду пептона [58] и у Chlorella protothecoides при добавлении глюкозы и мочевины [59]. В присутствии в среде моно- и дисахаридов у C. zofingiensis усиливался биосинтез астаксантина. Этот эффект был наиболее выражен в случае добавления глюкозы или сахарозы и слабее - при добавлении лактозы [46]. Существенно, что аналоги глюкозы не оказывают подобного влияния, поэтому этот эффект нельзя отнести на счет осмотической активности сахаров, добавленных в среду культивирования. Возможно, в индукции каротиногенеза участвуют молекулы-сенсоры глюкозы, например, гексокиназа, не исключено также участие механизма, основанного на изменении редокс-статуса цитоплазмы и тока электронов в дыхательной электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) [9].

 

ЛОКАЛИЗАЦИЯ ВТОРИЧНЫХ КАРОТИНОИДОВ

 

В отличие от первичных Кар, локализованных исключительно в тилакоидных мембранах хлоропластов, ВКар характеризуются экстратилакоидной локализацией (см. рис. 3). Установлено, что ВКар накапливаются в специализированных структурах, которые могут располагаться как в строме хлоропластов (например, глобулы с β-каротином у D. bardawil), так и экстрапластидно (примером могут служить цитоплазматические ОС у H. pluvialis). Таким образом, структуры, накапливающие ВКар, удалены от мембран, в близости от которых происходит синтез этих соединений [19]. При этом механизмы транспорта молекул Кар к накапливающим их структурам до настоящего времени остаются неизвестными.

Следует отметить, что в неблагоприятных условиях у микроводорослей формирование содержащих ВКар структур сопровождается выраженной редукцией гранально-ламеллярной системы хлоропластов [60, 61]. Тем не менее, даже после длительного воздействия стрессоров в пластидах Dunaliella [36] и Parietochloris [40] с высоким содержанием ВКар присутствуют сохранившие структурную и функциональную целостность тилакоиды, способные поддерживать фотосинтез. По всей видимости, это обстоятельство объясняет быстрое восстановление ФСА многих микроводорослей после их переноса в благоприятные условия [61].

Структуры, выполняющие функции депо ВКар, в целом сходны по своей организации. Так, каротиноидные гранулы, характерные для представителей рода Dunaliella, представляют собой липидные структуры, стабилизированные расположенным по периферии этих структур 38-кД белком CPG (от Carotene Globule Protein), синтез которого активируется одновременно с синтезом β-каротина ([43], см. также рис. 2). Предположить наличие аналогичной функции у CRTO - белка, присутствующего в ОС H. pluvialis, сложно из-за низкого количества CRTO. По последним данным [62], у этого вида структура ОС, содержащих астаксантин, стабилизируется недавно открытым специализированным белком HOGP (от Haematococcus Oil Globule Protein). Структура этих белков существенно отличается от таковой олеозинов высших растений [62].

 

СВЯЗЬ БИОСИНТЕЗА ВТОРИЧНЫХ КАРОТИНОИДОВ И НЕЙТРАЛЬНЫХ ЛИПИДОВ

 

Все описанные в предыдущем разделе структуры, содержащие ВКар, образуются с участием нейтральных липидов, прежде всего триацилглицеринов (ТАГ) [9, 63]. Это делает возможным накопление больших количеств относительно полярных ксантофиллов в гидрофобном окружении ОС. Кроме того, у H. pluvialis и каротиногенных представителей рода Chlorella на заключительных этапах формирования цист > 95% Кар представлено эфирами астаксантина и ЖК, преимущественно из семейства С18 [11, 13]. На первых этапах каротиногенеза у H. pluvialis в моноэфирах астаксантина преобладает олеиновая кислота (С18:1), а примерно через 24 ч преобладающей становится стеариновая кислота (С18:0) [9]. Не исключено, что в этерификации молекул астаксантина могут участвовать ЖК, отщепляемые липазами от ТАГ, синтезированных de novo при стрессе [9, 63].

Индукция биосинтеза ВКар у H. pluvialis и других каротиногенных микроводорослей сопровождается интенсивным накоплением ТАГ на фоне выраженного снижения содержания хлоропластных липидов. При этом наблюдается повышение активности ацетил-КоА-карбоксилазы, ключевого фермента биосинтеза глицеролипидов [30]. 

На ультраструктурном уровне это проявляется как формирование ОС в цитоплазме и редукция гранально-ламеллярной системы хлоропластов [35, 38, 61]. Установлено, что на долю ТАГ у этой микроводоросли приходится более 95% липидов ОС, содержащих ВКар; характерные для хлоропластов моногалактозилдиацилглицерины в них отсутствуют. Мембранные липиды составляют около 5% суммарных липидов ОС, окруженных однослойной мембраной. В их состав также входит фосфатидилэтанол, характерный для внепластидных мембран, а также диацилглицерилтриметилгомосерин — главный липид мембран ОС [34, 64].

Данные обстоятельства обуславливают существование тесной связи между биосинтезом ВКар и липидным метаболизмом, в частности биосинтезом ЖК и ТАГ ([19, 34, 61, 63, 65] и рис. 4). Сильная корреляция между накоплением Кар и ТАГ обнаружена у D. bardawil [26, 30, 66], H. pluvialis [21, 63, 67], P. incisa, ее мутанта P127 [54, 65] и ряда других микроводорослей. Накоплению ВКар сопутствуют характерные изменения жирнокислотного состава, отражающие повышение доли ТАГ, содержащих преимущественно олеиновую кислоту (С18:1) [63, 66].

Следует отметить, что образование липидных структур, выполняющих функции депо ВКар, возможно и без индукции биосинтеза последних, тогда как индукция каротиногенеза в отсутствие данных структур невозможна. Так, ведущим фактором каротиногенеза у D. bardawil является синтез ТАГ. Блокирование последнего химическими ингибиторами, не действующими на ферменты биосинтеза Кар, останавливает и накопление β-каротина [30]. Дополнительным свидетельством в пользу существования этой связи является тот факт, что включение меченого ацетата в молекулы липидов всегда предшествует росту активности ферментов биосинтеза Кар [30].

Напротив, ингибирование биосинтеза ВКар не приводит к прекращению накопления ТАГ [67]. Предполагается, что при формировании гидрофобных структур, способных накапливать ВКар, возникает сток для Кар, сдвигающий химическое равновесие в сторону, благоприятную для синтеза Кар. Не исключено также существование более специфичных механизмов, например, снижения ингибирования ферментов биосинтеза Кар конечным продуктом вследствие его удаления в липидные структуры [30].

 

ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ ВТОРИЧНЫХ КАРОТИНОИДОВ

 

Долгое время вопрос о функциях ВКар у микроводорослей, в отличие от цветковых растений, оставался неясным. Несмотря на существенный прогресс в исследовании физиологической роль ВКар у микроводорослей, функции этих соединений до сих пор активно дискутируются. Отдельные исследователи считают, что биосинтез ВКар является тупиковой ветвью метаболизма, и пул ВКар не вовлекается в дальнейшие реакции [30]. Предполагается, что при возобновлении деления клеток микроводорослей в благоприятных условиях количество ВКар в расчете на клетку снижается преимущественно за счет их распределения между дочерними клетками, а не катаболизма (C. Aflalo, личное сообщение). В этой связи наличие у ВКар функции запасных веществ является маловероятным, хотя содержащие их липидные структуры такой функцией, скорее всего, обладают [68]. С учетом результатов последних исследований [5], на передний план выходит фотозащитная функция ВКар, которая реализуется у микроводорослей по различным механизмам. Получены свидетельства в пользу участия ВКар в экранировании избытка ФАР [7, 8, 68], в защите от фотоокислительного повреждения компонентов ФСА [69] и запасных липидов [70-72]. Рассмотрим эти функции более подробно.

Оптическое экранирование. К настоящему времени получена масса свидетельств более высокой устойчивости к действию сильного света в природных [12, 13] и лабораторных условиях [1, 6, 73] клеток зеленых микроводорослей, обладающих высоким содержанием ВКар. Существенно, что эти клетки особенно устойчивы к действию излучения в сине-зеленой области ФАР, в которой Кар сильно поглощают свет [6]. Важно также, что адаптированные к высоким интенсивностям света клетки D. salina, обладающие высоким содержанием β-каротина и низким - хлорофилла (Хл), характеризуются высокой скоростью фотосинтеза (600 мкмоль O2/(мг Хл ч) [14]). Таким образом, ВКар существенно снижают степень фотоингибирования под действием высоких потоков ФАР. 

По данным Katz с соавт. [49], для эффективного выполнения фотозащитной функции ВКар важна структурная стабильность ОС, содержащих эти пигменты. Стабилизация ОС делает возможной концентрирование в них хромофоров (молекул ВКар). В результате этого процесса эффективность поглощения света данными пигментами, и, следовательно, ослабления избыточной ФАР, существенно повышается [8, 13]. Дополнительным свидетельством участия ОС, содержащих высокие количества ВКар, является их активная реакция на действие высоких потоков ФАР. Так, у H. pluvialis на сильном свету ОС быстро (за несколько минут) перемещались на периферию клетки, формируя экран, защищающий хлоропласт от фотоповреждения (C. Aflalo, личное сообщение).

С учетом этих фактов, а также принимая во внимание пространственную удаленность структур, содержащих ВКар, от компонентов ФСА, можно думать, что важным механизмом фотозащитного действия ВКар, накапливающихся в больших количествах при действии стрессоров различной природы, является оптическое экранирование избытка ФАР [8].

Подавление образования АФК и их детоксикация. Известно, что Кар являются мощными антиоксидантами [5] - перехватчиками свободных радикалов и тушителями 1O2. Имеются свидетельства антиоксидантного действия ВКар (свободного астаксантина и его эфиров с ЖК) у микроводорослей [10, 74]. Однако сомнительно, что ВКар способны эффективно элиминировать АФК, генерируемые в мембранах тилакоидов, благодаря внетилакоидной локализации этих пигментов. По всей видимости, ВКар защищают от перекисного окисления запасные липиды, накапливающиеся в ОС, а также другие компоненты клетки, такие как ядро. Предполагается, что ОС, содержащие ВКар и располагающиеся вокруг ядра, формируют физико-химический барьер, перехватывающий АФК и защищающий ДНК от окислительного повреждения [11, 42]. Имеются также предположения о том, что синтез оксигенированных Кар может способствовать снижению концентрации О2 в клетках или отдельных компартментах клеток микроводорослей [9]. Существенным фактором для снижения образования АФК в неблагоприятных условиях также может быть отток электронов с пластохинонового пула ЭТЦ хлоропластов на пластидную терминальную оксидазу (PTOX) при посредничестве десатураз в ходе биосинтеза Кар [75]. При этом присутствующий в хлоропласте молекулярный кислород в итоге восстанавливается до H2O, что дополнительно снижает вероятность образования АФК.

Сток для фотоассимилятов и запасание энергии. По-видимому, интенсивный биосинтез ВКар, как и биосинтез ТАГ [68], в неблагоприятных условиях обеспечивает сток для избыточных фотоассимилятов [11], снижая тем самым риск фотоокислительного повреждения вследствие избыточной восстановленности переносчиков электронов в ЭТЦ хлоропластов. Дополнительным стоком для фотоассимилятов может служить биосинтез ЖК, необходимых для этерификации ВКар, например, астаксантина, и их дальнейшего накопления в ОС [63, 76]. Предполагается, что ВКар также могут служить для запасания связанного углерода и энергии; этот запас мог бы утилизироваться при восстановлении роста культуры после стресса [69]. Однако систематические исследования катаболизма ВКар, насколько нам известно, не проводились.

 

ОПТИЧЕСКИЙ МОНИТОРИНГ ВТОРИЧНОГО КАРТИНОГЕНЕЗА

 

Радикальная перестройка пигментного аппарата при каротиногенезе, индуцированном стрессом, сопровождается глубокими и направленными изменениями оптических свойств клеток микроводорослей. Как правило, они включают значительное повышение поглощения света в синей [6, 54, 65] либо (в случае видов, накапливающих кетокаротиноиды) сине-зеленой области спектра (рис. 5, [13, 75]). Нередко эти изменения происходят на фоне снижения поглощения в красной области спектра, отражающего снижение содержания Хл. Анализ нормированных и (или) дифференциальных спектров поглощения суспензий клеток и сопоставление его результатов с данными биохимического анализа пигментов позволяют отнести наблюдаемые при каротиногенезе изменения на счет роста вклада ВКар в поглощение света микроводорослями [54, 61, 65, 76]. 

Следует отметить, что детальное описание спектральной картины изменений оптической плотности суспензий при каротиногенезе невозможно без устранения неопределенностей, возникающих под влиянием светорассеяния на полосы поглощения пигментов (подробнее о влиянии светорассеяния на спектры суспензий микроводорослей и способы его устранения см. в работе [77]). Корреляционный анализ спектров поглощения суспензий, не обладающих фунцией светорассеяния, и данных о содержании ВКар свидетельствует о тесной связи между поглощением света в синей области и содержанием ВКар в биомассе либо соотношением ВКар/Хл ([54, 61, 65] и рис. 6).

Эти результаты позволили разработать спектральные индексы для экспресс-оценки потенциальной устойчивости культур H. pluvialis к фотоповреждению [73], а также для оценки относительного содержания ВКар и параллельного определения содержания ценных ЖК в суспензиях культивируемых микроводорослей [54, 65, 78].

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

 

Обширный массив экспериментальных данных, накопленный за последние годы, свидетельствует о важной роли вторичного каротиногенеза в физиологии стресс-толерантности многих представителей Chlorophyta. Способность к индукции синтеза ВКар и накоплению их в больших количествах является характерной особенностью экстремофильных видов микроводорослей [9, 43]. Процесс накопления ВКар характеризуется рядом существенных особенностей по сравнению с синтезом первичных Кар. Так, ВКар характеризуются внетилакоиодной и (или) внепластидной локализацией. Как правило, функцию депо ВКар выполняют липидные глобулы (ОС), локализованные в строме пластид либо в цитоплазме. Эти структуры состоят преимущественно из нейтральных липидов (главным образом, ТАГ), окружены однослойной мембраной со специфическим составом полярных липидов и стабилизируются расположенными на границе с цитоплазмой специализированными белками. В цитоплазматических липидных глобулах могут локализоваться ферменты, катализирующие завершающие этапы биосинтеза оксигенированных ВКар, в частности, астаксантина у H. pluvialis (первичные Кар синтезируются исключительно в хлоропластах).

Между синтезом ВКар и нейтральных липидов (ТАГ), формирующих депо для ВКар, существует тесная связь. Ключевые роли в регуляции каротиногенеза играют сток для молекул ВКар (его обеспечивают ОС, формирующиеся при накоплении ТАГ, характерном для микроводорослей при стрессе [68]), и доступность ЖК для этерификации вторичных ксантофиллов. Видимо, в благоприятных условиях биосинтез ВКар замедлен, скорее всего, вследствие ингибирования ферментов биосинтеза ВКар конечными продуктами. В стрессовых условиях сток ВКар в липидные глобулы ослабляет ингибирование ферментов биосинтеза Кар, что приводит к запуску каротиногенеза. Универсальными факторами индукции и регуляции синтеза ВКар также являются АФК, образующиеся в фотоавтотрофных клетках при действии различных стрессоров, прежде всего, света высокой интенсивности.

В заключение следует отметить, что функция ВКар у фотоавтотрофных микроорганизмов, таких как одноклеточные зеленые водоросли, является многогранной и далеко не полностью изученной. Тем не менее, не вызывает сомнений участие индукции вторичного каротиногенеза, во многих случаях опосредованной АФК, в ответах на стрессы различной природы. Результатом этого процесса является существенное повышение устойчивости к неблагоприятным факторам среды, обеспечивающее выживание и процветание каротиногенных микроводорослей в экологических нишах с самыми суровыми условиями.

Углубленное понимание физиологии вторичного каротиногенеза позволит разработать более эффективные фотобиотехнологии для их промышленного получения из биомассы микроводорослей. Этому должны способствовать и успехи в исследовании связи между изменениями оптических свойств микроводорослей и динамики накопления ВКар, открывшие возможности для оценки содержания пигментов и мониторинга состояния лабораторных и промышленных культур-продуцентов Кар.

Автор выражает признательность к.б.н. О.Б. Чивкуновой за помощь в работе над рукописью.

Работа выполнена при частичной финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (контракт № 16.512.11.2182).

 

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Wang B., Zarka A., Trebst A., Boussiba S. Astaxanthin Accumulation in Haematococcus pluvialis (Chlorophyceae) as an Active Photoprotective Process under High Irradiance // J. Phycol. 2003. V. 39. P. 1116-1124.

Zhang D.H., Lee Y.K. Two-Step Process for Ketocarotenoid Production by a Green Alga Chlorococcum sp. Strain Ma-1 // Appl. Мicrobiol. Biotechnol. 2001. V. 55. P. 537-540.

Remias D., Lьtz-Meindl U., Lьtz C. Photosynthesis, Pigments and Ultrastructure of the Alpine Snow Alga Chlamydomonas nivalis // Eur. J. Phycol. 2005. V. 40. P. 259-268.

Remias D., Karsten U., Lьtz C., Leya T. Physiological and Morphological Processes in the Alpine Snow Alga Chloromonas nivalis (Chlorophyceae) during Cyst Formation // Protoplasma. 2010. V. 243. P. 73-86.

Ладыгин В.Г., Ширшикова Г. Современные представления о функциональной роли каротиноидов в хлоропластах эукариот // Журн. общей биологии. 2006. Т. 67. С. 163-190.

Ben-Amotz A., Shaish A., Avron M. Mode of Action of the Massively Accumulated β-Carotene of Dunaliella bardawil in Protecting the Alga against Damage by Excess Irradiation // Plant Physiol. 1989. V. 86. P. 1286-1291.

Hagen C., Braune W., Bjцrn L. Functional Aspects of Secondary Carotenoids in Haematococcus lacustris (Volvocales). III. Action as a Sunshade // J. Phycol. 1994. V. 30. P. 241-248.

Соловченко А.Е., Мерзляк М.Н. Экранирование видимого и УФ излучения как фотозащитный механизм растений // Физиология растений. 2008. Т. 55. С. 803-822.

Lemoine Y., Schoefs B. Secondary Ketocarotenoid Astaxanthin Biosynthesis in Algae: A Multifunctional Response to Stress // Photosynth. Res. 2010. V. 106. P. 155-177.

Kobayashi M., Sakamoto Y. Singlet Oxygen Quenching Ability of Astaxanthin Esters from the Green Alga Haematococcus pluvialis // Biotechnol. Lett. 1999. V. 21. P. 265-269.

Boussiba S. Carotenogenesis in the Green Alga Haematococcus pluvialis: Cellular Physiology and Stress Response // Physiol. Plant. 2000. V. 108. P. 111-117.

Czygan F. Blood-Rain and Blood-Snow: Nitrogen-Deficient Cells of Haematococcus pluvialis and Chlamydomonas nivalis // Arch. Mikrobiol. 1970. V. 74. P. 69-76.

Bidigare R., Ondrusek M., Kennicutt M., Iturriaga R., Harvey H., Hoham R., Macko S. Evidence a Photoprotective for Secondary Carotenoids of Snow Algae // J. Phycol. 1993. V. 29. P. 427-434.

Ben-Amotz A., Avron M. On the Factors which Determine Massive β-Carotene Accumulation in the Halotolerant Alga Dunaliella bardawil // Plant Physiol. 1983. V. 72. P. 593-597.

Palozza P. Prooxidant Actions of Carotenoids in Biologic Systems // Nutr. Rev. 1998. V. 56. P. 257-265.

Nishino H., Murakoshi M., Tokuda H., Satomi Y. Cancer Prevention by Carotenoids // Arch. Biochem. Biophys. 2009. V. 483. P. 165-168.

Ye Z.-W., Jiang J.-G., Wu G.-H. Biosynthesis and Regulation of Carotenoids in Dunaliella: Progresses and Prospects // Biotechnol. Adv. 2009. V. 26. P. 352-360.

Borowitzka M. Carotenoid Production Using Microorganisms // Single Cell Oils / Eds Cohen Z., Ratledge C. Champaign, Illinois: AOCS Press, 2005. P. 124-137.

Cunningham F., Jr., Gantt E. Genes and Enzymes of Carotenoid Biosynthesis in Plants // Annu. Rev. Plant Biol. 1998. V. 49. P. 557-583.

Ладыгин В.Г. Биосинтез каротиноидов в пластидах растений // Биохимия. 2000. Т. 65. С. 1317-1333.

Boussiba S., Vonshak A. Astaxanthin Accumulation in the Green Alga Haematococcus pluvialis // Plant Cell Physiol. 1991. V. 32. P. 1077-1082.

Britton G. UV/Visible Spectroscopy // Carotenoids / Eds Britton G., Liaaen-Jensen S., Pfander H. Basel: Birkhauser Verlag, 1995. P. 13-62.

Green B., Durnford D. The Chlorophyll-Carotenoid Proteins of Oxygenic Photosynthesis // Annu. Rev. Plant Biol. 1996. V. 47. P. 685-714.

Del Campo J.A., Rodrı́guez H., Moreno J., Vargas M., Rivas J., Guerrero M.G. Lutein Production by Muriellopsis sp. in an Outdoor Tubular Photobioreactor // J. Biotechnol. 2001. V. 85. P. 289-295.

Del Campo J., Garcнa-Gonzбlez M., Guerrero M. Outdoor Cultivation of Microalgae for Carotenoid Production: Current State and Perspectives // Appl. Мicrobiol. Biotechnol. 2007. V. 74. P. 1163-1174.

Ben-Amotz A., Katz A., Avron M. Accumulation of β-Carotene in Halotolerant Alga: Purification and Characterization of β-Carotene-Rich Globules from Dunaliella bardawil (Chlorophyceae) // J. Phycol. 1982. V. 18. P. 529-537.

Bar E., Rise M., Vishkautsan M., Arad S. Pigment and Structural Changes in Chlorella zofingiensis upon Light and Nitrogen Stress // J. Plant Physiol. 1995. V. 146. P. 527-534.

Malis S.A., Cohen E., Ben Amotz A. Accumulation of Canthaxanthin in Chlorella emersonii // Physiol. Plant. 1993. V. 87. P. 232-236.

Pennington F.C., Haxo F.T., Borch G., Liaaen-Jensen S. Carotenoids of Cryptophyceae // Biochem. Syst. Ecol. 1985. V. 13. P. 215-219.

Rabbani S., Beyer P., Lintig J., Hugueney P., Kleinig H. Induced β-Carotene Synthesis Driven by Triacylglycerol Deposition in the Unicellular Alga Dunaliella bardawil // Plant Physiol. 1998. V. 116. P. 1239-1248.

Grьnewald K., Eckert M., Hirschberg J., Hagen C. Phytoene Desaturase Is Localized Exclusively in the Chloroplast and Up-Regulated at the mRNA Level during Accumulation of Secondary Carotenoids in Haematococcus pluvialis (Volvocales, Chlorophyceae) // Plant Physiol. 2000. V. 122. P. 1261-1268.

Lotan T., Hirschberg J. Cloning and Expression in Escherichia coli of the Gene Encoding β-C-4-Oxygenase, That Converts β-Carotene to the Ketocarotenoid Canthaxanthin in Haematococcus pluvialis // FEBS Lett. 1995. V. 364. P. 125-128.

Fraser P.D., Miura Y., Misawa N. In Vitro Characterization of Astaxanthin Biosynthetic Enzymes // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 6128-6135.

Grьnewald K., Hirschberg J., Hagen C. Ketocarotenoid Biosynthesis Outside of Plastids in the Unicellular Green Alga Haematococcus pluvialis // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 6023-6029.

Santos M.F., Mesquita J. Ultrastructural Study of Haematococcus lacustris (Girod.) Rostafinski (Volvocales). I. Some Aspects of Carotenogenesis // Cytology. 1984. V. 49. P. 215-228.

Vorst P., Baard R.L., Mur L.R., Korthals H.J., van den Ende H. Effect of Growth Arrest on Carotene Accumulation and Photosynthesis in Dunaliella // Microbiology. 1994. V. 140. P. 1411-1417.

Collins A.M., Jones H.D.T., Han D., Hu Q., Beechem T.E., Timlin J.A. Carotenoid Distribution in Living Cells of Haematococcus pluvialis (Chlorophyceae) // PLoS ONE. 2011. V. 6. P. e24302.

Grьnewald K., Hagen C. β-Carotene Is the Intermediate Exported from the Chloroplast during Accumulation of Secondary Carotenoids in Haematococcus pluvialis // J. Appl. Phycol. 2001. V. 13. P. 89-93.

Jin E., Polle J., Lee H., Hyun S., Chang M. Xanthophylls in Microalgae: From Biosynthesis to Biotechnological Mass Production and Application // J. Мicrobiol. Biotechnol. 2003. V. 13. P. 165-174.

Соловченко А.Е., Хозина-Голдберг И., Диди-Коэн Ш., Коэн Ц., Мерзляк М.Н. Влияние света и азотного голодания на содержание и состав каротиноидов зеленой водоросли Parietochloris incisa // Физиология растений. 2008. Т. 55. С. 507-515.

Kobayashi M., Kakizono T., Nagai S. Enhanced Carotenoid Biosynthesis by Oxidative Stress in Acetate-Induced Cyst Cells of a Green Unicellular Alga, Haematococcus pluvialis // Appl. Environ. Microbiol. 1993. V. 59. P. 867-873.

Fan L., Vonshak A., Zarka A., Boussiba S. Does Astaxanthin Protect Haematococcus against Light Damage? // Z. Naturforsch., C: BioSci. 1998. V. 53. P. 93.

Pick U. Dunaliella: A Model Extremophilic Alga // Isr. J. Plant Sci. 1998. V. 46. P. 131-139.

Steinbrenner J., Linden H. Light Induction of Carotenoid Biosynthesis Genes in the Green Alga Haematococcus pluvialis: Regulation by Photosynthetic Redox Control // Plant Mol. Biol. 2003. V. 52. P. 343-356.

Jaspers P., Kangasjдrvi J. Reactive Oxygen Species in Abiotic Stress Signaling // Physiol. Plant. 2010. V. 138. P. 405-413.

Ip P., Chen F. Employment of Reactive Oxygen Species to Enhance Astaxanthin Formation in Chlorella zofingiensis in Heterotrophic Culture // Proc. Biochem. 2005. V. 40. P. 3491-3496.

Shaish A., Avron M., Pick U., Ben-Amotz A. Are Active Oxygen Species Involved in Induction of β-Carotene in Dunaliella bardawil? // Planta. 1993. V. 190. P. 363-368.

Семененко В.Е., Абдуллаев А.А. Параметрическое управление биосинтезом β-каротина в клетках Dunaliella salina в условиях интенсивной культуры // Физиология растений. 1980. Т. 27. С. 31-41.

Katz A., Jimenez C., Pick U. Isolation and Characterization of a Protein Associated with Carotene Globules in the Alga Dunaliella bardawil // Plant Physiol. 1995. V. 108. P. 1657-1664.

Абдуллаев А.А., Семененко В.Е. Интенсивная культура Dunaliella salina Teod. и некоторые ее физиологические характеристики // Физиология растений. 1974. Т. 21. С. 1145-1153.

Droop M. Carotenogenesis in Haematococcus pluvialis // Nature. 1955. V. 175. P. 42.

Jahnke L. Massive Carotenoid Accumulation in Dunaliella bardawil Induced by Ultraviolet-A Radiation // J. Photochem. Photobiol., B: Biol. 1999. V. 48. P. 68-74.

White A., Jahnke L. Contrasting Effects of UV-A and UV-B on Photosynthesis and Photoprotection of β-Carotene in Two Dunaliella spp. // Plant Cell Physiol. 2002. V. 43. P. 877-884.

Solovchenko A., Khozin-Goldberg I., Cohen Z., Merzlyak M. Carotenoid-to-Chlorophyll Ratio as a Proxy for Assay of Total Fatty Acids and Arachidonic Acid Content in the Green Microalga Parietochloris incisa // J. Appl. Phycol. 2009. V. 21. P. 361-366.

Aflalo C., Bing W., Zarka A., Boussiba S. The Effect of the Herbicide Glufosinate (Basta) on Astaxanthin Accumulation in the Green Alga Haematococcus pluvialis // Z. Naturforsch., C: BioSci. 1999. V. 54. P. 49-54.

Borowitzka M.A., Borowitzka L.J., Kessly D. Effects of Salinity Increase on Carotenoid Accumulation in the Green Alga Dunaliella salina // J. Appl. Phycol. 1990. V. 2. P. 111-119.

Mendoza H., del Rio M.J., Reina G.G., Ramazanov Z. Low-Temperature-Induced Оіl-Carotene and Fatty Acid Synthesis, and Ultrastructural Reorganization of the Chloroplast in Dunaliella salina (Chlorophyta) // Eur. J. Phycol. 1996. V. 31. P. 329-331.

Abe K., Mihara H., Hirano M. Characteristics of Growth and Carotenoid Accumulation of the Aerial Microalga Trentepohlia aurea in Liquid Culture // J. Marin. Biotechnol. 1998. V. 6. P. 53-58.

Shi X.M., Chen F. High-Yield Production of Lutein by the Green Microalga Chlorella protothecoides in Heterotrophic Fed-Batch Culture // Biotechnol. Prog. 2002. V. 18. P. 723-727.

Владимирова М.Г. Ультраструктурная организация клетки Dunaliella salina и ее функциональные изменения в зависимости от интенсивности света и температуры // Физиология растений. 1978. Т. 25. С. 571-576.

Merzlyak M., Chivkunova O., Gorelova O., Reshetnikova I., Solovchenko A., Khozin-Goldberg I., Cohen Z. Effect of Nitrogen Starvation on Optical Properties, Pigments, and Arachidonic Acid Content of the Unicellular Green Alga Parietochloris incisa (Trebouxiophyceae, Chlorophyta) // J. Phycol. 2007. V. 43. P. 833-843.

Peled E., Leu S., Zarka A., Weiss M., Pick U., Khozin-Goldberg I., Boussiba S. Isolation of a Novel Oil Globule Protein from the Green Alga Haematococcus pluvialis (Chlorophyceae) // Lipids. 2011. V. 46. P. 851-861.

Zhekisheva M., Boussiba S., Khozin-Goldberg I., Zarka A., Cohen Z. Accumulation of Oleic Acid in Haematococcus pluvialis (Chlorophyceae) under Nitrogen Starvation or High Light Is Correlated with That of Astaxanthin Esters // J. Phycol. 2002. V. 38. P. 325-331.

Kьnzler K., Eichenberger W. Betaine Lipids and Zwitterionic Phospholipids in Plants and Fungi // Phytochemisry. 1997. V. 46. P. 883-892.

Solovchenko A., Merzlyak M., Khozin-Goldberg I., Cohen Z., Boussiba S. Coordinated Carotenoid and Lipid Syntheses Induced in Parietochloris incisa (Chlorophyta, Trebouxiophyceae) Mutant Deficient in Δ5 Desaturase by Nitrogen Starvation and High Light // J. Phycol. 2010. V. 46. P. 763-772.

Mendoza H., Martel A., del Rio M.J., Garcia Reina G. Oleic Acid Is the Main Fatty Acid Related with Carotenogenesis in Dunaliella salina // J. Appl. Phycol. 1999. V. 11. P. 15-19.

Zhekisheva M., Zarka A., Khozin-Goldberg I., Cohen Z., Boussiba S. Inhibition of Astaxanthin Synthesis under High Irradiance Does Not Abolish Triacylglycerol Accumulation in the Green Alga Haematococcus pluvialis (Chlorophyceae) // J. Phycol. 2005. V. 41. P. 819-826.

Соловченко А.Е. Физиологическая роль накопления нейтральных липидов эукариотическими микроводорослями при стрессах // Физиология растений. 2012. Т. 59. С. 192-202.

Hagen C., Braune W., Greulich F. Functional Aspects of Secondary Carotenoids in Haematococcus lacustris [Girod] Rostafinski (Volvocales). Iv: Protection from Photodynamic Damage // J. Photochem. Photobiol., B: Biol. 1993. V. 20. P. 153-160.

Семененко В.Е. Механизмы эндогенной регуляции фотосинтеза и адаптивные свойства хлоропласта // Физиология фотосинтеза / Под ред. Ничипоровича А.А. Москва: Наука, 1982. С. 164-187.

Рамазанов З.М., Клячко-Гурвич Г.Л., Ксенофонтов А.Л., Семененко В.Е. Влияние субоптимальной температуры на содержание β-каротина и липидов у галофильной водоросли Dunaliella salina // Физиология растений. 1988. Т. 35. С. 864-872.

Sun Z., Cunningham F.X., Gantt E. Differential Expression of Two Isopentenyl Pyrophosphate Isomerases and Enhanced Carotenoid Accumulation in a Unicellular Chlorophyte // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. P. 11 482-11 488.

Соловченко А.Е., Чивкунова O.Б., Маслова И.П. Пигментный состав, оптические свойства и устойчивость к фотодеструкции микроводоросли Haematococcus pluvialis, культивируемой при высокой освещенности // Физиология растений. 2011. Т. 58. С. 12-20.

Kobayashi M. In Vivo Antioxidant Role of Astaxanthin under Oxidative Stress in the Green Alga Haematococcus pluvialis // Appl. Мicrobiol. Biotechnol. 2000. V. 54. P. 550-555.

Li Y., Sommerfeld M., Chen F., Hu Q. Consumption of Oxygen by Astaxanthin Biosynthesis: A Protective Mechanism against Oxidative Stress in Haematococcus pluvialis (Chlorophyceae) // J. Plant Physiol. 2008. V. 165. P. 1783-1797.

Hu Q., Sommerfeld M., Jarvis E., Ghirardi M., Posewitz M., Seibert M., Darzins A. Microalgal Triacylglycerols as Feedstocks for Biofuel Production: Perspectives and Advances // Plant J. 2008. V. 54. P. 621-639.

Мерзляк М.Н., Чивкунова О.Б., Маслова И.П., Накви Р.К., Соловченко А.Е., Клячко-Гурвич Г.Л. Спектры поглощения и рассеяния света клеточными суспензиями некоторых цианобактерий и микроводорослей // Физиология растений. 2008. Т. 55. С. 464-470.

Solovchenko A., Khozin I., Chivkunova O. Real-Time Spectral Techniques for Detection of the Build up of Valuable Compounds and Stress in Microalgal Cultures: Implications for Biotechnology // Microalgae: Biotechnology, Microbiology and Energy / Ed. Johansen M. Hauppauge, New York: Nova Sci. Publ., 2011. P. 251-276.

ПОДПИСИ К РИСУНКАМ

Рис. 1. Путь биосинтеза вторичных каротиноидов. 

CRTL-B - ликопин-β-циклаза; CRTO - β-каротиноксигеназа; CRTR-B - β-кольца гидроксилаза; GGPS - геранилгеранилпирофосфатсинтаза; IPI - изопентенилпирофосфатизомераза; PDS - фитоиндесатураза; PSY - фитоинсинтаза; ZDS - ζ-каротиндесатураза (по [19] с изменениями).

 

Рис. 2. Гипотетический механизм индукции каротиногенеза у Dunaliella (по [43] с изменениями). 

а - стадия активации; б - каротиногенез. X - гипотетический рецептор; CBR - белок-гомолог ELIP, синтезируемый при каротиногенезе; PSY - фитоинсинтаза; PDS - фитоиндесатураза; CGP - белок-стабилизатор липидных глобул.

 

Рис. 3. Внетилакоидная локализация вторичных каротиноидов (β-каротина) у мутанта P127 зеленой микроводоросли Parietochloris incisa (по [65] с изменениями). 

Представлены нормированные по красному максимуму хлорофилла спектры поглощения экстрактов (в хлороформе) клеток P127 после 14 суток роста на полной среде BG-11 при высокой (270 мкЕ/(м2 с) ФАР; 1) и низкой (35 мкЕ/(м2 с) ФАР; 2) интенсивности света, а также их разностный спектр (1 - 2); 3 - спектр олеосом, выделенных из клеток, использованных для получения экстракта 1. Врезка: а - ВЭЖХ-хроматограмма экстракта клеток P127 (см. спектр 1), а также выделенных из этих клеток тилакоидов (б) и олеосом (в). Детектирование при 455 нм; пики: 1 - неоксантин, 2 - виолаксантин, 3 - антераксантин, 4 - лютеин, 4′ - зеаксантин, 5 - Хл b, 6 - Хл a, 7 - β-каротин. 

 

Рис. 4. Связь между биосинтезом вторичных каротиноидов и накоплением липидов в суспензии клеток мутанта Parietochloris incisa, дефицитного по гену Δ5-десатуразы, при стрессе, индуцированном действием света высокой интенсивность и недостатком азота в среде (по [65] с изменениями).

 

Рис. 5. Типичные изменения спектров поглощения суспензий вегетативных клеток H. pluvialis (0) при индукции накопления астаксантина (1–3) и образовании цист (4–8) за 8 суток культивирования при 50 Вт/(м2 сутки) ФАР (по [69] с изменениями).

 

Рис. 6. Спектр коэффициента корреляции (r) для зависимости оптических свойств суспензии клеток Parietochloris incisa, накапливающих β-каротин при недостатке азота в среде, от содержания пигментов (каротиноидов и хлорофиллов). 

На врезке представлена зависимость отношения OD480/OD678 от соотношения Кар/Хл (по [61] с изменениями).