УДК 581.1

ФИЗИОЛОГИЯ И БИОТЕХНОЛОГИЯ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ:

СОСТОЯНИЕ ИССЛЕДОВАНИЙ И ПЕРСПЕКТИВЫ

(ПО МАТЕРИАЛАМ МЕЖДУНАРОДНОЙ КОНФЕРЕНЦИИ “ФИЗИОЛОГИЯ И БИОТЕХНОЛОГИЯ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ”, 16–19 октября 2012 г., Москва)

© 2013 г. Д. А. Лось 

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки 

Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Москва

Поступила в редакцию 28.11.2012 г.

 

Этот номер журнала содержит статьи участников конференции “Физиология и биотехнология микроводорослей”, посвященной 80-летию со дня рождения профессора В.Е. Семененко (1932–1998), которая проходила в Москве с 16 по 19 октября 2012 г. Тематически сообщения на конференции разделились по четырем основным направлениям: а) молекулярные и генетическое механизмы регуляции физиологических процессов; б) экофизиология микроводорослей; в) биотехнология микроводорослей; г) биоразнообразие и коллекции микроводорослей. Целью конференции было объединение исследователей, работающих в разных областях физиологии, биохимии, биофизики, молекулярной биологии и биотехнологии, но использующих одни и те же объекты – микроводоросли и цианобактерии. В этой вводной статье рассматриваются проблемы, которые охватывала конференция, достижения в области изучения микроводорослей и цианобактерий и их практического применения.

 

Ключевые слова: микроводоросли – цианобактерии – альгология – биотехнология – физиология

--------------------------------

Сокращения: СКМ – СО2-концентрирующий механизм; ТФ – транскрипционный фактор.

Адрес для корреспонденции: Лось Дмитрий Анатольевич. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН. Факс: 007 (499) 977-93-72; электронная почта: losda@ippras.ru

 ВВЕДЕНИЕ

 

C 16 по 19 октября 2012 г. в Москве в Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН проходила международная конференция “Физиология и биотехнология микроводорослей”, приуроченная к 80-летию со дня рождения Виктора Ефимовича Семененко – основоположника современной альгологии и биотехнологии микроводорослей в России.

В этом выпуске журнала “Физиология растений” представлены статьи участников конференции, посвященные актуальным вопросам современной альгологии, микробиологии и биотехнологии фотосинтезирующих клеток, включая эукариотические микроводоросли и цианобактерии.

В.Е. Cемененко (19321998) известен в России и за ее пределами своим вкладом в изучение проблемы саморегуляции физиологических функций в фотосинтезирующих клетках. Он заложил фундаментальные основы биотехнологии микроводорослей как способа управления путями биосинтеза клетки через целенаправленные воздействия на их регуляторные системы. Работы Семененко в области физиологии, биохимии и практического применения микроводорослей начались в 50-х годах прошлого столетия и были связаны с использованием одноклеточных фотоавтотрофных микроорганизмов в замкнутых биологических системах жизнеобеспечения. Эти работы были инициированы в связи с успешным началом освоения космоса и появлением новой отрасли знания – космической биологии. В то время рассматривались перспективы длительных межпланетных путешествий, создания обитаемых инопланетных станций и орбитальных комплексов, одним из главных звеньев которых представлялись биологические системы жизнеобеспечения с использованием фотосинтезирующих организмов, в первую очередь – микроводорослей.

В самом начале этого цикла работ изучалась жизнеспособность и уровень мутаций в клетках Chlorella в условиях космического полета. Для этого уже 1958 г. были проведены эксперименты на непилотируемых спутниках, показавшие отсутствие заметных изменений в физиологическом и популяционном состояниях водорослей в полетном эксперименте [1]. Осуществлялся подбор наиболее перспективных для систем жизнеобеспечения форм одноклеточных водорослей, изучались условия интенсификации их роста, разрабатывались различные типы закрытых фотобиореакторов, в которых течение 1.5-месячного непрерывного эксперимента клетки Chlorella могли поставить 25–30 л кислорода в сутки с 1 л суспензии. Были сконструированы плоские фотобиореакторы, фотореакторы с использованием воздушных струйных насосов, турбосорберов с форсуночным распылением суспензии в освещаемом объеме, с распределением световой энергии в суспензии с помощью различных типов световодов [2].

Принципиальным условием, определявшим возможность применения биологической системы жизнеобеспечения, являлась высокая степень надежности и устойчивости звена микроводорослей. Разработанная В.Е. Семененко и Л.Н. Цоглиным в 1967 г. теория автоселекционных процессов в популяциях микроводорослей, будучи подтвержденной экспериментально, надежно гарантировала стабильность газообменных характеристик биологического звена и показала возможность интенсификации фотосинтетических и продукционных показателей микроводорослей в процессе их длительного непрерывного культивирования [3].

Наряду с регенерацией атмосферы в задачи биологической системы жизнеобеспечения входит и обеспечение полноценного рациона питания экипажа. Вопросы регулирования биохимической направленности фотосинтетического метаболизма клеток микроводорослей стали одним из основных направлений исследований В.Е. Семененко, вылившихся впоследствии в предложенную им теорию эндогенной регуляции фотосинтеза [4]. Работы в этом направлении привели к подбору форм-продуцентов различного рода соединений и разработке методов управления биохимическим составом микроводорослей с помощью широкого спектра экстремальных воздействий на культуру [5]. Предложенный в 70-х годах метод двухфазного культивирования микроводорослей дал возможность вести процесс непрерывного получения биомассы с заданным химическим составом без снижения фотосинтетической активности микроводорослей.

Вместе с исследованиями эндогенной регуляции фотосинтеза его продуктом – глюкозой [4], Семененко занимала проблема проявления саморегуляции фотосинтеза при его ограничении недостатком углекислоты. В этих исследованиях В.Е. Семененко исходил из гипотезы о том, что низкая концентрация СО2 в современной атмосфере Земли является одним из факторов планетарного масштаба, ограничивающих фотосинтез микроводорослей и, по-видимому, всех С3-растений. В начале 70-х годов после открытия С4-фотосинтеза получила распространение точка зрения, что способность концентрировать СО2 в клетке является отличительной особенностью С4-растений, тогда как С3-растения не обладают этой способностью. В то время многие исследователи занимались судьбой углерода у С3-растений уже после его взаимодействия с РБФК, тогда как транспорт СО2 в клетку в лучшем случае отмечался в виде сопротивления диффузии СО2. Тем не менее, ряд таких фактов, как несоответствие между действительным сродством РБФК к СО2 и его расчетными концентрациями в строме хлоропласта, увеличение фотосинтетического сродства к СО2 при адаптации клеток к снижению уровня диоксида углерода в среде, способность микроводорослей расти в отсутствие СО2 на средах, содержащих бикарбонат, находились в противоречии с гипотезой о прямой диффузии СО2 к центрам карбоксилирования и показывали, что обеспечение субстратом темновых реакций фотосинтеза находится под генетическим контролем клетки [6].

К теоретической части работ принадлежит гипотеза Семененко о важной роли пиреноида, содержащего РБФК/О и карбоангидразу, в концентрировании, генерации и фиксации СО2 в хлоропласте. Исследования В.Е. Семененко, проведенные совместно с его женой и соратником М.Г. Владимировой, в которых впервые была показана локализация РБФК/О в пиреноидах, хорошо известны среди специалистов, занимающихся проблемой углеродного метаболизма [7]. Полученные экспериментальные данные и сделанные на их основе обобщения позволили В.Е. Семененко сформулировать концепцию о функциональной роли CO2-концентрирующего механизма (СКМ) как о целостной интегрированной системе, в которой решающую роль играют компартментация, селективные свойства мембран, градиент протона, локализация и топология карбоангидраз, трансмембранный перенос неорганического углерода. Эта концепция расширила представления о фотосинтетическом метаболизме и позже нашла дальнейшие экспериментальные подтверждения [8, 9].

С целью сохранения биоразнообразия микроводорослей, поддержания стабильности используемых в исследованиях и в технологических процессах штаммов микроводорослей В.Е. Семененко и М.Г. Владимировой была создана Коллекция микроводорослей IPPAS, которая входит в Международную ассоциацию коллекций – ECCO (European Culture Collection Organization).

Целью прошедшей конференции “Физиология и биотехнология микроводорослей” было объединение исследователей, работающих в разных областях физиологии, биохимии, биофизики, молекулярной биологии и биотехнологии, но использующих одни и те же объекты – микроводоросли и цианобактерии. Доклады на конференции, помимо сессии, посвященной памяти В.Е. Семененко, разделились по четырем основным направлениям.

1. Молекулярные и генетическое механизмы регуляции физиологических процессов.

2. Экофизиология микроводорослей.

3. Биотехнология микроводорослей.

4. Биоразнообразие и коллекции микроводорослей.

На конференции присутствовало более 100 зарегистрированных участников из 9 стран, включая Белоруссию, Болгарию, Великобританию, Германию, Казахстан, Россию, США, Чехию, Южную Корею, Японию. Российские участники были представлены научно-образовательными учреждениями Борка (Ярославская обл.), Владивостока, Геленджика, Екатеринбурга, Ижевска, Иркутска, Казани, Краснодара, Москвы, Новосибирска, Оренбурга, Пущино, Санкт-Петербурга, Стерлитамака, Сыктывкара, Улан-Уде.

 

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ И ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ

 

Наша планета обязана цианобактериям и микроводорослям возникновением современной кислородной атмосферы, обусловившей появление эукариотической клетки и развитие животного и растительного мира в том виде, в котором мы сегодня его наблюдаем. Будучи фотосинтезирующими организмами и основными компонентами фитопланктона, эти организмы и в нынешнее время поставляют в атмосферу до 50% кислорода и обеспечивают депонирование до 40% всего углерода, имеющегося на планете.

Относительная простота организации цианобактерий и одноклеточных водорослей делают их удобным объектом для изучения механизмов разнообразных процессов регуляции – от основополагающих физических процессов, связанных с расщеплением воды и выделением кислорода до сложнейших взаимодействий биологических макромолекул в процессах восприятия и передачи сигналов о внутриклеточных или внеклеточных изменениях. Такая регуляция осуществляется на разных уровнях, включая окислительно-восстановительные реакции, метаболические циклы, гормональный контроль, события на уровне изменений топологии ДНК, транскрипции, трансляции, посттрансляционной модификации, изменения активности ферментов и т.д.

Так, фундаментальные основы регуляции разных физиологических процессов у цианобактерий с помощью цАМФ были представлены в докладе M. Ohmori (Chuo University, Tokyo, Japan). Этот цикл работ показывает ключевую роль цАМФ в регуляции таких процессов, как ответы клеток на изменения освещенности, кислотности и солености среды, недостаток влаги. У цианобактерий обнаружено более 20 генов аденилатциклаз, участвующих в биосинтезе цАМФ и его контроле. Каталитические домены этих ферментов очень похожи между собой, в то время как стресс-воспринимающие домены весьма различаются, что свидетельствует о разной структурной базе, необходимой для восприятия различных стрессовых воздействий. Мутагенез этих генов позволил определить клеточные процессы, в которые они вовлечены. Так, выключение гена cyaC у нитчатой цианобактерии Anabaena приводило к потере клетками способности регулировать изменение внутриклеточной концентрации цАМФ при оводнении после потери влаги, что, в свою очередь, вызывало окислительный стресс [10]. У одноклеточной цианобактерии Synechocystis уровень внутриклеточного цАМФ возрастал на синем свету, который стимулирует подвижность клеток. Выключение гена аденилатциклазы cya1 приводило к полной утрате клетками подвижности, а добавление экзогенного цАМФ восстанавливало подвижность. Взаимодействие цАМФ со своим рецепторным комплексом (CRP) вызывало экспрессию генов, кодирующих компоненты клеточной поверхности (пили), обусловливающих подвижность клеток.

Тонкие механизмы взаимодействия углеродного и азотного метаболизма у азотфиксирующей цианобактерии Anabaena были представлены в сообщении S. Ehira (Chuo University, Tokyo, Japan). Известно, что определенные вегетативные клетки Anabaena могут дифференцироваться в так называемые гетероцисты, которые специализируются на фиксации азота. Это возможно благодаря пространственной изоляции этих компартментов, в которых инактивирован кислород-выделяющий комплекс ФС II и, соответственно, доступ кислорода, и активен нитрогеназный комплекс, осуществляющий фиксацию азота. Такая изоляция от диффузии кислорода внутрь достигается за счет плотного слоя полисахаридов и гликолипидов, обволакивающих клеточную стенку гетероцисты. Однако поскольку гетероцисты не могут фотосинтезировать, то очевидна их зависимость от вегетативных фотосинтезирующих клеток в части поставки углеводов, необходимых как для строительства кислородного барьера, так и для создания восстановительного потенциала, требующегося для азотфиксации. Таким образом, процессы углеводного метаболизма и азотфиксации должны быть тесно скоординированы на молекулярном уровне. Действительно, экспрессия гена nrrA, кодирующего ДНК-связывающий регулятор ответа, увеличивается в ответ на недостаток азота под контролем транскрипционного фактора (ТФ) NtcA, являющегося глобальным регулятором генов, вовлеченных в азотный метаболизм у цианобактерий [11]. Белок NrrA напрямую регулирует транскрипцию гена hetR, продукт которого является основным индуктором дифференциации гетероцист и активирует экспрессию множества генов, участвующих в формировании этих клеток. NrrA вовлечен в регуляцию формирования гетероцист, но при этом еще и контролирует катаболизм гликогена. Это выяснилось после выключения гена nrrA, вызвавшего замолкание ряда генов (glgP1, оперон xfp-gap1-pyk1-talB), участвующих в утилизации гликогена. Одновременно с увеличением концентрации гликогена наблюдалось и уменьшение активности нитрогеназы. Оказалось, что NrrA связывается с промоторами генов гликогенфосфорилазы glgP1 и сигма-фактора РНК полимеразы sigE. Фактор SigE, в свою очередь, активирует транскрипцию оперона xfp, кодирующего ферменты гликолиза и пентозофосфатного пути. Таким образом, показан генетический контроль формирования гетероцист и катаболизма гликогена через ДНК-связывающий регулятор ответа NrrA [11].

Регуляция азотного метаболизма у эукариот была рассмотрена в докладе K. Tanaka (Tokyo Institute of Technology, Yokohama, Japan) на примере красной водоросли Cyanidioschyzon merolae, живущей в горячих кислых источниках. Этот организм способен использовать аммоний или нитрат в качестве единственных источников азота. Анализ геномной последовательности и иммунолокализации показали, что два основных фермента азотного метаболизма – глутаминсинтаза (GS) и глутаматсинтетаза (GOGAT) – находятся, соответственно, в цитоплазме клеток и в ее хлоропластах. В то же время, гена нитритредуктазы (NiR) в геноме обнаружено не было, несмотря на присутствие гена нитратредуктазы (NR). Исследования показали, что у этого организма при недостатке азота индуцируются два ядерных гена, кодирующие белки, подобные сульфитредуктазам (SiR). При этом продукты этих генов, экспрессированные в клетках цианобактерий, проявляли нитритредуктазную активность [12]. Транскрипционный фактор, контролирующий регуляцию азотного метаболизма, был обнаружен при анализе транскриптомных профилей при азотном голодании. Таким фактором оказался продукт гена MYB (MYB1), который специфически связывается с промоторами генов, индуцируемых при внесении в питательную среду азота.

Еще одним важным аспектом регуляции азотного метаболизма является анализ сигнальных белков семейства РII, которые модулируют белок-белковые взаимодействия и контролируют широкий спектр мишеней в клетке, включающих ферменты, транскрипционные факторы и белки-транспортеры. Структурно-функциональные особенности различных представителей белков этого семейства рассмотрены в эволюционном аспекте в сообщении Е.В. Ермиловой (СПбГУ, Санкт-Петербург) [13].

Успехи в сравнительном изучении механизмов деления клеток цианобактерий и пластид растений на уровне функциональной геномики и протеомики были представлены в сообщении О.А. Кокшаровой (НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ, Москва) [14], а протеомный подход при изучении функций серин-треониновых протеинкиназ эукариотического типа у цианобактерий при стрессовых ответах, в частности, при тепловом шоке, был продемонстрирован А.А. Зориной (ИФР РАН, Москва) [15]. Роль пролиновых аминопептидаз цианобактерий в биогенезе белков фотосинтетического аппарата обсуждалась в сообщении Е.С. Пожидаевой (ИФР РАН, Москва) [16]. 

М.М. Бабыкин (МГУ, Москва) представил новейшие сведения о гомеостазе ионов железа у цианобактерий. У Synechocystis sp. PCC 6803 известны 23 гена, вовлеченные в метаболизм железа, причем 19 из них являются компонентами транспортеров железа. Пять генов составляют системы транспорта трехвалентного (FutABC) и двухвалентного (FeoB) железа из периплазматического пространства в цитоплазму. Остальные 14 генов, включая 3 гена exbB, exbD и tonB, обеспечивающих транспорт ионов железа через внешнюю мембрану к цитоплазматической, кодируют компоненты железо-сидерофорных комплексов. Эти 14 генов образуют один кластер вместе с 5 генами, предположительно кодирующими ТФ семейства AraC – pcrR, pchR1 и pchR2. Дефицит железа приводит к активации этого кластера, а одновременное выключение этих трех генов приводит к снижению транскрипции некоторых генов, вовлеченных в поддержание гомеостаза железа. Важно, что клетки Synechocystis, сами по себе не способные образовывать полноценные сидерофоры, не могут восстановить рост при экзогенном добавлении таких сидерофоров, как энтеробактин или феррихром. В то же время, добавление к Fe-дефицитным клеткам фильтрата среды от Anabaena variabilis ATCC 29413, продуцирующей сидерофор дегидроксаматного типа, полностью восстанавливает рост клеток Synechocystis дикого типа, но не его мутанта, дефектного по гену tonB. Таким образом, экспериментально показано, что клетки одних цианобактерий могут использовать определенные Fe-сидерофоры других цианобактерий, а транспорт экзогенных сидерофоров осуществляется через TonB.

Огромный прогресс за последние два десятилетия обозначился в исследовании транскрипционного аппарата хлоропластов. R.G. Herrmann (Ludwig-Maximilians-Universität, München, Germany) и Е.А. Лысенко (ИФР РАН, Москва) представили систематизированные данные об эволюции и устройстве транскрипционного аппарата хлоропластов различных водорослей и высших растений, эволюция которых проходила независимо друг от друга [17, 18]. С другой стороны, на вопрос о молекулярных механизмах взаимодействия хлоропласта и ядра, который задавался и 20 лет назад, и гораздо ранее, однозначных и четких ответов до сих пор не получено. Возможно, ответы на эти вопросы будут получены уже в скором времени в связи со значительными успехами в методологии генетической инженерии хлоропластов, обзор которых дал Saul Purton (University College London, UK) [19].

Различные аспекты функционирования хлоропластов были затронуты в сообщениях Н.П. Юриной (ИНБИ РАН, Москва), О.Н. Болдиной (БИН РАН, Санкт-Петербург), А.С. Чунаева (СПбГУ, Санкт-Петербург).

K. Bisova (Institute of Microbiology, Academy of Sciences of Czech Republic, Třeboň) представила результаты изучения координации клеточного цикла и ответов клеток микроводорослей на повреждения ДНК. Для выяснения участия протеинкиназы Wee1 в регуляции циклин-зависимых протеинкиназ, регулирующих клеточный цикл, проанализировали 20 тыс. мутантов Chlamydomonas с нарушенной работой промотора гена Wee1, направляющего синтез репортерной люциферазы, в ответ на повреждение геномной ДНК. Полученные данные свидетельствуют о том, что экспрессия Wee1 в клеточном цикле и при повреждении ДНК контролируется разными механизмами.

Эволюционные аспекты систем регуляции разного уровня были рассмотрены в докладах Г.А. Романова, Г.В. Новиковой, Г.В. Шевченко (ИФР РАН, Москва). Г.А. Романов обобщил знания о сенсорных гистидинкиназах, обладающих так называемыми CHASE-доменами, и способных функционировать в качестве сенсоров цитокининов. Эти протеинкиназы обнаруживаются у всех наземных растений, начиная со мхов и плаунов, но пока не обнаружены в геномах водорослей, таких как Chlamydomonas reinhartii, Volvox carteri. Предполагается, что способность воспринимать цитокинины как гормоны и сама цитокининовая сигнальная система появляются у многоклеточных растений в связи с их выходом на сушу.

Г.В. Новиковой представлены новые данные об участии фитогормонов и их рецепторов (включая также и пути передачи гормональных сигналов) в регуляции клеточного цикла в культурах клеток растений. Эта регуляция осуществляется многокомпонентной регуляторной системой, включающей транскрипционный уровень, белок-белковые взаимодействия, процессы фосфорилирования/дефосфорилирования, а также деградацию белков [20]. Г.В. Шевченко показала предварительные данные о возможности существования в клетках цианобактерий белков, способных взаимодействовать с гормонами высших растений.

 

Регуляция фотосинтеза

 

Различные штаммы микроводорослей и цианобактерий издавна служили главными объектами для изучения различных аспектов функционирования фотосинтетического аппарата. Благодаря использованию этих объектов и применению методов генетической инженерии, прежде всего, обеспечивающих возможность направленного мутагенеза генов, кодирующих компоненты фотосинтетического аппарата, был достигнут значительный прогресс в понимании устройства систем переноса электронов, восприятия света, преобразования световой энергии в энергию биохимических связей, молекулярных основ биоэнергетики [21, 22].

Механизмы регуляции транспорта электронов при протекании первичных процессов фотосинтеза были рассмотрены в сообщении А.Б. Рубина (МГУ, Москва). Различные уровни защиты фотосинтетического аппарата от фотоповреждения, а также использование альтернативных путей переноса электронов были представлены Н.В. Карапетяном (ИНБИ РАН, Москва) и И.В. Еланской (МГУ, Москва).

Роль ферментов антиоксидантной защиты – каталазы-пероксидазы KatG и супероксиддисмутазы Fe-SOD в защите фотосинтетического аппарата от окислительного стресса продемонстрировали И.Р. Фомина и В.Д. Креславский (ИФПБ РАН, Пущино) [23]. Роль точечных мутаций в гене основного белка ФС II (D1) в обеспечении термостабильности ФС II показана в докладе О.В. Шлык-Кернер (Удмуртский ГУ, Ижевск). Регуляция транспорта электронов вокруг ФС II в условиях дефицита серы описана математической моделью и подкреплена экспериментально Т.Ю. Плюсниной (МГУ, Москва) [24].

 

ЭКОФИЗИОЛОГИЯ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ

 

Фитопланктон, составной частью которого являются микроводоросли, представляет собой сложную динамическую систему, подверженную сезонным изменениям численности доминирующих видов. Такие изменения проанализированы В.А. Силкиным (Южный филиал Института океанографии РАН, Геленджик) на примере фитопланктонных организмов акватории Черного моря, представленных, в основном, двумя группами водорослей – диатомовыми и кокколитофоридами. Кокколитофориды обладают более эффективной системой усвоения азота по сравнению с диатомеями, в то время как диатомеи имеют более эффективные системы усвоения фосфора. Таким образом, первые преобладают при низких концентрациях азота (весной и ранним летом), а вторые, – когда в воду попадают большие количества азота, – летом и осенью.

Е.В. Куприяновой (ИФР РАН, Москва) показаны данные о карбоангидразах реликтовых цианобактерий, их роли в поддержании внутри- и внеклеточного рН и функционировании ССМ [25]. Л.Г. Попова (ИФР РАН, Москва) представила долгожданные результаты изучения структуры и функционирования Na+-АТФаз галотолерантных микроводорослей [26]. Е.А. Селиванова (Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН, Оренбург) охарактеризовала физиологические особенности нового штамма галофильной водоросли Dunaliella salina IPPAS D-232, выделенного из сверхсоленого озера Развал (Соль-Илецк, Оренбургская обл.) [27]. Е.С. Лобакова и А.Е. Соловченко (МГУ, Москва) рассказали о молекулярно-филогенетическом анализе зеленой микроводоросли Desmodesmus, выделенной из губки, обитающей в Белом море, и об исследовании влияния освещенности и азотного голодания на оптические свойства этого хлорофита и состав пигментов и жирных в нем [28, 29]. 

 

БИОТЕХНОЛОГИЯ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ

 

Большое внимание на конференции было уделено различным аспектам практического использования микроводорослей и проблемам их массового культивирования в связи с растущими потребностями различных отраслей экономики в биомассе разных видов и штаммов микроводорослей.

С.В. Шестаков (МГУ, Москва) рассказал о фотобиотехнологиях в связи с перспективой использование цианобактерий в качестве продуцентов молекулярного водорода на основе биоконверсии солнечной энергии. Поскольку образование водорода обеспечивается бинаправленной и поглощающей гидрогеназами, фотопродукция водорода может быть увеличена путем применения к этим ферментам генетических методов. В частности, речь шла об идентификации мутаций, приводящих к усилению продукции водорода и использовании этих знаний для направленного мутагенеза при получении штаммов-суперпродуцентов водорода [30]. О возможностях получения водорода с помощью клеток эукариотических зеленых водорослей говорил А.А. Цыганков (ИФПБ РАН, Пущино).

О плоскостенных фотобиореакторах и их использовании в изучении множества параметров при непрерывном культивировании рассказал L. Nedbal (Institute of Systems Biology & Ecology, Academy of Sciences of Czech Republic, Drasov). Такие фотореакторы позволяют прослеживать динамику развития культивируемых штаммов в режиме реального времени. В реакторах контролируется состав и подача газовоздушной смеси, измеряется pH суспензии, концентрация растворенного CO2, активность фотосинтеза и дыхания клеток. С использованием такой технологии культивирования были обнаружены синхронные циркадные колебания метаболических процессов в клетках цианобактерий в стационарной фазе роста. О промышленном производстве биомассы микроводорослей и успехах собственного предприятия в этой сфере, а также об основных принципах конструирования фотобиореакторов доложил O. Pulz (IGV Institut für Getreideverarbeitung, Nuthetal, Germany). Возможности регулирования условий культивирования фототрофных микроорганизмов в большой степени определяются конструкцией фотобиореакторов. С.И. Погосян (МГУ, Москва) отметил, что наиболее важными являются такие параметры фотобиореакторов, как длина оптического пути, возможности изменения скорости перемешивания суспензии фототрофных микроорганизмов, минимальные потери света и предельные значения интенсивности облучения. Он также сформулировал требования, которым должна удовлетворять конструкция фотобиореакторов.

Большое внимание было уделено использованию липидов микроводорослей в качестве биотоплива. Характеристику липидного метаболизма и способов манипуляции им у известного продуцента липидов Botryococcus braunii представила И. Гущина (Cardiff University, UK). Возможности так называемого “двухфазного культивирования” для получения углеводов и липидов охарактеризовал V. Zachleder (Institute of Microbiology, Academy of Sciences of Czech Republic, Třeboň). Новые штаммы, потенциально способные производить разумные количества липидов, пригодных для получения биотоплива, были охарактеризованы Б.К. Заяданом (Казахский национальный университет им. Аль-Фараби, Алматы, Казахстан) [31]. Расчетами эффективности и экономической выгоды производства биотоплива из микроводорослей поделилась со слушателями Antje Boback (IGV Institut für Getreideverarbeitung, Nuthetal, Germany).

Результаты практического использования циано-бактериальных ассоциаций для очистки почв от нефтепродуктов были представлены Н.Ш. Акимбековым (Казахский национальный университет им. Аль-Фараби, Алматы, Казахстан) [32]. 

Е.А. Бутакова (НИИ комплексного использования и охраны водных ресурсов, Екатеринбург) предложила гипотезу, объясняющую появление в водоемах веществ-одорантов – геосмина и 2-метилизоборнеола, выделяемых цианобактериями и придающих неприятный запах питьевой воде. Многолетние наблюдения показали, что запах появляется только в те годы и тогда, когда на уровне фитопланктонного сообщества в водоемах происходит смена двух главных доминирующих видов. Высказано предположение о том, что одоранты принимают участие в регуляции численности цианобактерий. Однако не исключено, что эти вещества появляются просто в результате гибели и распада клеток цианобактерий, способных к их внутриклеточному синтезу [33].

В.Н. Сычев (ИМБП РАН, Пущино) представил данные об использовании микроводорослей в биологических системах жизнеобеспечения будущих орбитальных станций. Те аспекты практического использования микроводорослей, с которых началось интенсивное изучение физиологии и молекулярной биологии этих организмов, до сих пор не потеряли актуальности. Создание планетарных баз начинается с создания основных инженерных сооружений, а процесс создания систем жизнеобеспечения – после окончания их строительства, когда внутренний объем базы будет полностью отделен от окружающего пространства. Как сообщил В.Н. Сычев, на первом этапе во время строительства базы и в начале ее функционирования основным элементом системы жизнеобеспечения будет система, в которой автотрофное звено будет представлено только одноклеточными водорослями, за счет фотосинтеза которых в системе будет происходить регенерация атмосферы и воды. В дальнейшем функции автотрофного звена будут передаваться от низших растений к высшим, которые, после создания необходимых площадей оранжерей, возьмут на себя бόльшую часть функций автотрофного эвена, а освободившиеся мощности альго-бактериального сообщества будут выводиться в резерв системы. Однако микроводоросли будут продолжать функционировать в составе автотрофного звена, а их доля будет определяться тем количеством азота, который необходимо вернуть в систему.

 

БИОРАЗНООБРАЗИЕ И КОЛЛЕКЦИИ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ

 

Отдельный раздел работы конференции был посвящен состоянию и деятельности коллекций микроводорослей в РФ. Значимость таких коллекций охарактеризовал в своем сообщении А.А. Гончаров (БПИ ДВО РАН, Владивосток), который подчеркнул, что коллекции начали играть существенную роль после того, как водоросли стали активно использовать в различных биотехнологических программах, прежде всего, при разработке методов получения биотоплива. Поскольку прямой отбор водорослей с требуемыми физиологическими свойствами и характеристиками из природных сообществ за редким исключением невозможен, скрининг уже имеющихся штаммов является первым этапом любого прикладного исследования. А.А. Гончаров привел данные о регистрации российских коллекций в международных базах данных (http://www.wfcc.info), где представлены шесть российских коллекций микроорганизмов, имеющих в своем составе водоросли (ACCS, BOROK, CALU, IPPAS, PGC, ИБМ ДВО РАН). Число штаммов в этих коллекциях, как правило, не превышает 300 (тогда как каталоги ведущих мировых коллекций насчитывают по 2000–3000 штаммов), большинство изолятов не является оригинальными, а интерактивные каталоги отсутствуют. Кроме этого, в России существует ряд коллекций, не имеющих официального статуса, сосредоточенных преимущественно в учреждениях, занимающихся изучением разнообразия водорослей на региональном (иногда и более широком) уровне – БашГУ, БГПУ, БИН РАН, БПИ ДВО РАН, ИБ Коми НЦ УрО РАН и некоторые другие. По мнению А.А. Гончарова, ситуацию с развитием коллекций культур водорослей в России нельзя считать удовлетворительной. Возможно, потребуется федеральная программа, призванная объединить усилия всех исследователей и технологов, заинтересованных в развитии коллекций в РФ и использовании их потенциала для развития высокотехнологичных производств.

Е.Н. Патова (Институт биологии Научного центра Коми УрО РАН, Сыктывкар) привела данные об исследованиях Коллекции культур микроводорослей из горных и тундровых районов севера Европы. Эта коллекция на данный момент имеет 70 альгологически чистых штаммов, выделенных преимущественно из почвы предполярного и заполярного Урала, Югорского полуострова, норвежского Свальбарда. Среди коллекционных штаммов имеются такие представители, как Porphyrosiphon lomniczensis, Dictyococcus varians, Graesiella vacuolata, Scenedesmus abundans, Scenedesmus cf. acutus, Pseudococcomyxa cf. pringsheimii, Elliptochloris reniformis и др.

Е.С. Гусев и М.С. Куликовский (Институт биологии внутренних вод им. И.Д. Папанина РАН, Борок) рассказали о своих работах в Коллекции тропических водорослей и Коллекции диатомовых водорослей. Формирование коллекции культур тропических водорослей началось в 2011 г. с выделением первых штаммов водорослей из проб, собранных в Центральном и Южном Вьетнаме. Коллекция занимается биогеографией пресноводных водорослей, а также исследованием их морфологического и генетического разнообразия на примере тропических популяций. В настоящее время в коллекции насчитывается более 400 альгологически чистых штаммов различных групп водорослей и цианобактерий. Основную часть коллекции составляют водоросли класса Zygnematophyceae, представленные 220 штаммами из 18 родов: Actinotaenium (4 таксона), Closterium (15), Cosmarium (18), Cosmoastrum (4), Cylindrocystis (1), Desmidium (2), Euastridium (1), Euastrum (11), Gonatozygon (2), Micrasterias (2), Netrium (1), Penium (1), Onychonema (2), Pleurotaenium (3), Spondylosium (1), Staurastrum (15), Staurodesmus (8), Xanthidium (2).

Исследования Коллекции диатомовых водорослей в данный момент сосредоточены на характеристике видового разнообразия диатомовых водорослей о. Байкал. Уже сейчас выделено 320 штаммов, представляющих 34 рода центрических и пеннатных диатомовых водорослей. Центрические диатомовые представлены 20 штаммами из родов Aulacoseira, Cyclotella, Discostella, Melosira, Thalassiosira. Пеннатные диатомовые представлены родами Amphora, Anomoeoneis, Caloneis, Craticula, Cymbella, Cymbopleura, Eunotia, Eolimna, Fallacia, Fragilariforma, Fragilaria, Geissleria, Gomphonema, Mayamea, Navicula, Neidium, Nitzschia, Paraplaconeis, Placoneis, Pinnularia, Planothidium, Rhopalodia, Sellaphora, Stauroneis, Staurosira, Staurosirella, Surirella, Tabellaria, Ulnaria.

А.Д. Темралеева (Институт физико-химических и биологических проблем почвоведения, Пущино) поделилась результатами своих исследований в области культивирования почвенных цианобактерий и водорослей. Ее работы показали, что полностью воспроизводить химический состав почвенного раствора при культивировании нецелесообразно. Достаточно добавлять в стандартные среды приближенный аналог почвенного раствора – почвенную вытяжку. Если учесть, что пересев водорослей из почвы на культуральные среды является стрессом, то переход от многовидового альго-цианобактериального сообщества в почве к монокультуре на питательной среде должен состоять из нескольких последовательных стадий: почва  смешанная культура, полученная с помощью чашечных и водно-почвенных культур  монокультура на среде с почвенной вытяжкой  монокультура на минеральной среде (если требуется). Выбор фунгицидов и антибиотиков для очистки культур должен быть индивидуальным для разных групп почвенных водорослей. Использование стандартных протоколов очистки культур в большинстве случаев не дает должного эффекта.

Способы оценки физиологического состояния и жизнеспособности клеток микроводорослей были рассмотрены в докладах Д. Таширевой (University of South Bohemia, České Budějovice, Czech Republic) и Т. Башариной (Лимнологический институт СО РАН, Иркутск). Филогенетическое определение микроводорослей путем анализа ДНК, выделенной из единственной клетки, было показано Н.В. Анненковой (Лимнологический институт СО РАН, Иркутск).

Конференция показала, что работы в области физиологии, биохимии, генетики и молекулярной биологии микроводорослей и цианобактерий проводятся в РФ достаточно активно и на высоком уровне. Об этом свидетельствуют и публикации в отечественных и международных изданиях. Вместе с тем, разработки в области практического использования микроводорослей со стороны участников из России были представлены мало. Это свидетельствует о том, что работы в области биотехнологии микроводорослей по-прежнему недостаточно востребованы и слабо поддерживаются в России по сравнению с другими странами, хотя фундаментальная база для таких работ была заложена и до сих пор имеется именно здесь.

Благодарим компанию ООО “СТО-Груп” и А.С. Халяпину (ИФР РАН) за помощь в проведении конференции.

Конференция была поддержана грантом Российского фонда фундаментальных исследований (№ 12-04-06054-г) и Президиумом Российской академии наук. 

 

 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

 

1. Семененко В.Е., Владимирова М.Г. Влияние условий космического полета на корабле-спутнике на сохранение жизнеспособности культуры хлореллы // Физиология растений. 1961. Т. 8. С. 743–749. 

2. Цоглин Л.Н., Габель Б.В., Фалькович Т.Н., Семененко В.Е. Фотобиореакторы закрытого типа для культивирования микроводорослей // Физиология растений. 1996. Т. 43. С. 149–155.

3. Цоглин Л.Н., Владимирова М.Г., Семененко В.Е. Математическое и экспериментальное моделирование процесса автоселекции микроводорослей в условиях проточного культивирования // Физиология растений. 1970. Т. 17. С. 1129–1139.

4. Семененко В.Е. Молекулярно-биологические аспекты эндогенной регуляции фотосинтеза // Физиология растений. 1978. Т. 25. С. 903–921.

5. Семененко В.Е., Владимирова М.Г., Орлеанская О.Б. К физиологической характеристике Chlorella sp. при высоких экстремальных температурах. I. Разобщающее действие экстремальных температур на клеточные функции хлореллы // Физиология растений. 1967. Т. 14. С. 612–625.

6. Пронина Н.А., Семененко В.Е. Молекулярная и клеточная организация СО2-концентрирующих механизмов в фотоавтотрофных клетках микроводорослей // Альгология. 1991. Т. 1. С. 80–92.

7. Владимирова М.Г., Маркелова А.Г., Семененко В.Е. Выявление локализации рибулозобисфосфаткарбоксилазы в пиреноидах одноклеточных водорослей цитоиммунофлуоресцентным методом // Физиология растений. 1982. Т. 29. С. 941–950.

8. Маркелова А.Г., Синетова М.П., Куприянова Е.В., Пронина Н.А. Распределение и функциональная роль карбоангидразы Cah3 в тилакоидной мембране хлоропласта и пиреноида Chlamydomonas reinhardtii // Физиология растений. 2009. Т. 56. С. 844–853.

9. Куприянова Е.В., Пронина Н.А. Карбоангидраза – фермент, преобразивший биосферу // Физиология растений. 2011. Т. 58. С. 162–176.

10. Higo A., Ikeuchi M., Ohmori M. cAMP Regulates Respiration and Oxidative Stress during Rehydration in Anabaena sp. PCC 7120 // FEBS Lett. 2008. V. 582. P. 1883–1888.

11. Ehira S. Transcriptional Regulation of Heterocyst Differentiation in Anabaena sp. Strain PCC 7120 // Физиология растений. 2013. Т. 60. C.

12. Imamura S., Terashita M., Ohnuma M., Maruyama S., Minoda A., Weber A.P., Inouye T., Sekine Y., Fujita Y., Omata T., Tanaka K. Nitrate Assimilatory Genes and Their Transcriptional Regulation in a Unicellular Red Alga Cyanidioschyzon merolae: Genetic Evidence for Nitrite Reduction by a Sulfite Reductase-Like Enzyme // Plant Cell Physiol. 2010. V. 51. P. 707–717.

13. Ермилова Е.В., Форчхаммер К. Сигнальные белки PII цианобактерий и зеленых водорослей – новые функции консервативных белков // Физиология растений. 2013. Т. 60. С.

14. Васетенков А.Е., Кокшарова О.А. Сравнительные и эволюционные аспекты изучения механизмов деления клеток цианобактерий и пластид растений // Физиология растений. 2013. Т. 60. С.

15. Зорина А.А. Протеинкиназы эукариотического типа у цианобактерий // Физиология растений. 2013. Т. 60. С.

16. Пожидаева Е.С., Малтерер C., Баик А.С., Соколенко А.В. Инактивация гена sll0136 у Synechocystis sp. PCC 6803 приводит к нарушению биогенеза фотосинтетических белков // Физиология растений. 2013. Т. 60. С.

17. Lysenko E.A. Plant Sigma Factors and Their Role in Plastid Transcription // Plant Cell Rep. 2007. V. 26. P. 845–859.

18. Geimer S., Belicová A., Legen J., Sláviková S., Herrmann R.G., Krajcovic J. Transcriptome Analysis of the Euglena gracilis Plastid Chromosome // Curr. Genet. 2009. V. 55. P. 425–438.

19. Purton S., Szaub J.B., Wannathong T., Young R., Economou C.K. Genetic Engineering of Algal Chloroplasts: Progress and Prospects // Физиология растений. 2013. Т. 60. С.

20. Новикова Г.В., Носов А.В., Степанченко Н.С., Фоменков А.А., Мамаева А.С., Мошков И.Е. Пролиферация клеток растений и ее регуляция // Физиология растений. 2013. Т. 60. С.

21. Карапетян Н.В. Нефотохимическое тушение флуоресценции у цианобактерий // Биохимия. 2007. Т. 72. С. 1385–1395.

22. Allakhverdiev S.I. Recent Progress in the Studies of Structure and Function of Photosystem II // J. Photochem. Photobiol. B. 2011. V. 104. P. 1–8.

23. Креславский В.Д., Фомина И.Р., Иванов А.А., Татаринова Н.П., Кособрюхов А.А., Биль К.Я., Херберт С.К. NaCl-стимулированное фотоингибирование и восстановление фотосинтетической активности мутанта katG- цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803 // Биофизика. 2010. Т. 55. С. 252–258.

24. Плюснина Т.Ю., Ризниченко Г.Ю., Рубин А.Б. Регуляция электрон-транспортных путей в клетках Chlamydomonas reinhardtii в условиях стресса // Физиология растений. 2013. Т. 60. С. . 

25. Куприянова Е.В., Синетова М.А., Cho S.M., Park Y.-I., Маркелова А.Г., Лось Д.А., Пронина Н.А. Особенности системы карбоангидраз алкалофильных цианобактерий // Физиология растений. 2013. Т. 60. С.

26. Попова Л.Г., Балнокин Ю.В. Na+-АТФазы галотолерантных микроводорослей // Физиология растений. 2013. Т. 60. С.

27. Немцева Н.В., Селиванова Е.А., Игнатенко М.Е., Шарапова Н.В. Характеристика нового штамма Dunaliella salina (Chlorophyta) и оценка параметров его культивирования // Физиология растений. 2013. Т. 60. С.

28. Соловченко А.Е., Чивкунова О.Б., Семенова Л.Р., Селях И.О., Щербаков П.Н., Карпова Е.А., Лобакова Е.С. Влияние стрессов на содержание пигментов и жирных кислот липидов в клетках микроводоросли Desmodesmus sp. из Беломорского гидроида // Физиология растений. 2013. Т. 60. С.

29. Кравцова Т.Р., Лазебная И.В., Лазебный О.Е., Волкова Е.Ю., Федоренко Т.А., Горелова О.А., Баулина О.И., Лобакова Е.С., Васетенков А.Е., Кокшарова О.А. Молекулярная филогения зеленой водоросли, изолированной из губки Halichondria panicae (Pallas, 1766), Белого моря // Физиология растений. 2013. Т. 60. С.

30. Шестаков С.В. Вклад метагеномики в развитие биотехнологии // Биотехнология. 2011. Т. 6. С. 8–22.

31. Dyo Y.M., Vonlanthen S.E., Purton S., Zayadan B.K. Evaluating New Isolates of Microalgae from Kazakhstan for Biodiesel Production // Физиология растений. 2013. Т. 60. С.

32. Жубанова А.А., Ерназарова А.К., Кайырманова Г.К., Заядан Б.К., Савицкая И.С., Абдиева Г.Ж., Кистаубаева А.С., Акимбеков Н.Ш. Конструирование циано-бактериального консорциума на основе аксеничных культур цианобактерий и гетеротрофных бактерий для биоремедиации нефтезагрязненных почв и водоемов // Физиология растений. 2013. Т. 60. С.

33. Бутакова Е.А. Особенности одорирующих веществ (геосмина и 2-метилизоборнеола) как вторичных метаболитов цианобактерий // Физиология растений. 2013. Т. 60