УДК 581.1

АКТИВНОСТЬ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ И ФОНД НЕСТРУКТУРНЫХ УГЛЕВОДОВ В ЛИСТЕ ЗЕЛЕНЕЮЩИХ ПРОРОСТКОВ ЯРОВОЙ ПШЕНИЦЫ

© 2014 г. Е. В. Гармаш, Р. В. Малышев, М. А. Шелякин, Т. К. Головко

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки 

Институт биологии Коми научного центра Уральского отделения РАН, Сыктывкар

Поступила в редакцию 26.12.2012 г.

Исследовали динамику дыхания, соотношение дыхательных путей и их связь с содержанием растворимых углеводов в листе проростков яровой пшеницы (Triticum aestivum L.) при зеленении на непрерывном свету (ФАР 190 мкмоль/(м2 с)) в течение 48 ч. Изменения дыхания листа в процессе деэтиоляции были тесно связаны с модуляцией активности альтернативного пути (АП). Скорость цитохромного дыхания (ЦП) прямо зависела от содержания углеводов и скорости роста. Это позволяет заключить, что во время зеленения субстратная регуляция активности ЦП опосредована энергетическими потребностями процессов роста и эффективно осуществляется с помощью механизма дыхательного контроля. Максимальные значения скорости АП были зарегистрированы спустя 6 ч экспозиции проростков к свету. Соотношение ЦП/АП в этот период было близко единице. Активность АП в процессе деэтиоляции изменялась независимо от содержания растворимых углеводов, что указывает на существование, помимо субстратной регуляции, других более сложных механизмов вовлечения АП. Наши результаты свидетельствуют в пользу представлений об участии альтернативного пути дыхания в поддержании гомеостаза фототрофных клеток в период становления фотосинтетической функции. 

---------------------------------------

Сокращения: АО – альтернативная оксидаза; Дт – активность темнового дыхания, измеренного по скорости выделения СО2; ИРП  интенсивность радиации приспособления; ОСР  скорость роста листа; СГК  салицилгидроксамовая кислота; ТБК-РП – реагирующие с тиобарбитуровой кислотой продукты; Фв – скорость видимого фотосинтеза; ЦП, АП – цитохромный и альтернативный путь дыхания соответственно; Fv/Fm – максимальный квантовый выход ФС II; qP, qN – фотохимическое и нефотохимическое тушение флуоресценции хлорофилла соответственно; Vcyt, Valt – активность ЦП и АП соответственно; Vt – активность темнового дыхания, измеренного по скорости поглощения О2.

Адрес для корреспонденции: Гармаш Елена Владимировна. 167982 Сыктывкар, ул. Коммунистическая, 28. Институт биологии Коми научного центра УрО РАН. Факс: 007 (8212) 24-01-63; электронная почта: garmash@ib.komisc.ru

Ключевые слова: Triticum aestivum – деэтиоляция – альтернативное дыхание – цитохромное дыхание – углеводы – рост

 

ВВЕДЕНИЕ

Лист как специализированный орган фотосинтеза обеспечивает растение восстановленным углеродом и энергетическими эквивалентами (НАД(Ф)·Н, АТФ). Часть запасенной в ассимилятах энергии извлекается при дыхании и используется на рост и поддержание функциональной активности и целостности клеточных структур. Углеводы могут влиять на дыхание прямо (как дыхательные субстраты) и опосредованно – через энергопотребляющие процессы и, прежде всего, рост [1]. Поэтому важную роль в регуляции связи дыхательной активности растений с углеводами играет дыхательный контроль (соотношение АТФ/АДФ и НАД·Н/НАД+). Механизм дыхательного контроля, регулирующий скорость синтеза АТФ в зависимости от энергетических нужд, функционирует не только на клеточном уровне, но и на уровне ткани [2, с. 5].

В ЭТЦ митохондрий перенос электронов с пула убихинона осуществляется по основному цитохромному (ЦП) и нефосфорилирующему альтернативному (цианидрезистентному) пути (АП) через альтернативную оксидазу (АО). Влияние углеводов на АП является предметом дискуссии с тех пор, как была выдвинута гипотеза “сверхпотока” (“energy overflow”) [3]. Согласно этой идее, АП участвует в окислении избытка углеводов в тканях, а в современной интерпретации – в регуляции баланса между углеводным метаболизмом и скоростью транспорта электронов [4]. Считается, что вовлечение АП стабилизирует окислительно-восстановительный баланс в митохондриальной ЭТЦ за счет быстрого окисления НАД·Н и препятствует генерации избыточного количества АФК [4, 5 и др.]. В фотосинтезирующих листьях на свету АП может участвовать в окислении восстановительных эквивалентов, поступающих из хлоропластов в митохондрии посредством малат-оксалоацетатного челнока, способствуя тем самым “разгрузке” ЭТЦ хлоропластов [6]. Экспрессия генов АО индуцируется светом через фоторецепторы или через механизмы, связанные с активацией фотосинтетического метаболизма и изменением пула углеводов [7]. Наблюдаемое в ряде исследований усиление активности АП при экспозиции растений к повышенной освещенности авторы объясняли увеличением содержания углеводов [8–11]. В других экспериментах такая зависимость не была обнаружена [8, 9]. Важно отметить, что эти исследования были проведены преимущественно на зрелых листьях со сформированным мезофиллом, и эффект углеводов на АП часто зависел от отношения растения к световым условиям среды, степени их светолюбия или теневыносливости. 

Сведения о регуляции дыхательных путей и вовлечении АП при зеленении, в процессе которого осуществляется становление фотосинтетического аппарата и переход листа на фототрофный тип питания, очень скудные. В работе [12] было показано, что повышение активности АП в семядолях сои при зеленении в условиях нормального фотопериода не связано с изменением их углеводного статуса. Следует отметить, что семядоли сои являются запасающими органами. Основную часть их запасных веществ составляют белки и липиды (триацилглицериды) [13]. При прорастании семян и формировании проростков белки семядолей гидролизуются до аминокислот, а липиды с участием липаз распадаются на глицерол и жирные кислоты, которые подвергаются -окислению, метаболизируются в глиоксалатном цикле и глюконеогенезе с образованием сахаров. Все это существенно усложняет выявление связи дыхания с углеводами при деэтиоляции.

Цель данной работы заключалась в выявлении закономерностей изменения дыхательной активности и анализе связи дыхательных путей с углеводным статусом формирующегося первого листа проростков пшеницы в процессе деэтиоляции на постоянном свету. Круглосуточное освещение использовали, чтобы избежать флуктуаций концентрации сахаров, обусловленных сменой дня и ночи. 

 

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Семена пшеницы (Triticum aestivum L., сорт Иргина) в течение суток замачивали в воде при комнатной температуре. Затем семена промывали, сливали воду и оставляли еще на сутки во влажной камере в темноте. Двухсуточные проклюнувшиеся семена распределяли на рамки с сеткой, помещали на кюветы объемом 3 л с 1/2 нормы раствора Кнопа и проращивали в течение четырех суток в климатической камере (“Binder”, Германия) в полной темноте при 21°С и влажности 60%. На пятые сутки включали лампы, и этиолированные проростки оставляли под непрерывным светом (ФАР 190 мкмоль/(м2 с)) в течение 48 ч. В отдельном эксперименте проростки после 6 ч деэтиоляции помещали в условия длительной темноты (18 ч), чтобы уменьшить фонд углеводов. Для исследований отбирали среднюю часть листовой пластинки первого листа четырех- и пятисуточных этиолированных проростков спустя 1, 2, 4, 6, 12, 24 и 48 ч их экспозиции на свету. Всего было проведено три независимых серии экспериментов.

Рост листа оценивали по накоплению биомассы. Пробы (первый лист 20 проростков) взвешивали и высушивали до воздушно-сухого состояния при 70°С. Относительную скорость роста листа (ОСР, г/(г сухой массы ч)) определяли, как разность натуральных логарифмов массы листа в разные периоды времени [14]. 

Определения СО2-газообмена (видимый фотосинтез, Фв, или выделение СО2 интактными листьями в темноте, Дт) проводили в открытой системе с помощью подключенного по дифференциальной схеме инфракрасного газоанализатора Li-7000 (“Li-COR Inc.”, США). Среднюю часть пластинки 45 интактных листьев площадью 0.250.30 дм2 помещали в термостатируемую листовую камеру объемом 30 см3, через которую прокачивали воздух со скоростью 60 л/ч. Температуру в камере (20 ± 2°С) контролировали, используя микротермистор МТ-54 с неравновесным мостом НМ-31 (Россия). Камеру освещали лампой ДРЛФ (Россия) мощностью 1 кВт. 

Величину Фв измеряли при интенсивности ФАР 190 мкмоль/(м2 с). Кривую зависимости Фв от освещенности получали, экспонируя лист сначала при минимальной ФАР, затем интенсивность ФАР ступенчато повышали до максимального уровня – 1000 мкмоль/(м2 с). В конце эксперимента камеру затемняли, и измеряли Дт. Методика определения ключевых параметров световой кривой была подробно описана нами ранее [15]. Все определения фотосинтеза и дыхания проводили в 6–8-кратной биологической повторности.

Показатели индуцированной флуоресценции хлорофилла определяли с помощью портативного флуориметра РАМ-2100 (“Walz”, Германия), руководствуясь инструкцией производителя (“Heinz Walz GmbH”, 2003). Сначала измеряли величину стационарного (Ft), фонового (F0ʹ) и максимального (Fmʹ) уровня флуоресценции хлорофилла листа, адаптированного к действующему свету (190 мкмоль/(м2 с)). После 30 мин темновой адаптации листьев регистрировали фоновый (F0) и максимальный (Fm) уровни флуоресценции. F0 измеряли на слабом красном свету с частотой модуляций 600 Гц, не вызывающих фотохимической реакции; Fm измеряли после короткого импульса (0.8 с) насыщающего света 4000 мкмоль /(м2 с). Максимальный квантовый выход фотохимической активности ФС II (Fv/Fm) рассчитывали как (Fm – Fо)/Fm. Величину фотохимического (qP) и нефотохимического (qN) тушения флуоресценции хлорофилла находили как (Fmʹ – Ft)/(Fmʹ – F0ʹ) and (Fm – Fmʹ)/(Fm – F0ʹ) соответственно. Показатели индуцированной флуоресценции хлорофилла измеряли в 8–12-кратной биологической повторности.

Концентрацию хлорофиллов в листовых пластинках определяли спектрофотометрически в ацетоновых вытяжках при длинах волн 662 и 644 (хлорофиллы а и b) в 5-кратной биологической повторности. 

Интенсивность дыхания измеряли по скорости поглощения О2 при 21°С полярографически с использованием электрода Кларка (“Oxytherm system”, Hansatech Inst., Англия). Высечки средней части первого листа общей массой 15–20 мг помещали в реакционный сосуд объемом 2 мл, содержащий 1.5 мл буфера Hepes (50 мм, pH 7.2), при постоянном перемешивании.

Для ингибирования цитохромного дыхания использовали 2 мМ КСN, альтернативного – 3 мМ салицилгидроксамовую кислоту (СГК). Оптимальные концентрации ингибиторов определены путем титрования высечек листа возрастающими концентрациями ингибиторов до насыщения скорости поглощения О2 [16]. Активность общего дыхания определяли в отсутствие ингибиторов (Vt). Активность остаточного дыхания (Vres), измеренная при совместном действии ингибиторов (СГК и KCN), не превышала 10% от Vt. Активность цитохромного пути дыхания (Vcyt) определяли по степени чувствительности дыхания к КСN за вычетом Vres. Активность альтернативного пути дыхания (Valt) определяли по степени чувствительности дыхания к СГК в присутствии КСN за вычетом Vres. Изучение скорости поглощения О2 и влияния ингибиторов на дыхание проводили в 6–8-кратной биологической повторности. 

Содержание растворимых углеводов и качественный состав растворимой фракции низкомолекулярных сахаров, включающей моно-, ди- и олигосахариды, определяли методом нормально-фазовой ВЭЖХ. Фиксацию проб свежего растительного материала (1–3 г) и экстрагирование из них углеводов проводили 96 и 80% этиловым спиртом соответственно. Экстракты очищали от сопутствующих примесей методом твердофазной экстракции на концентрирующих патронах Диапак-амин (“БиоХимМак”, Россия). Анализ растворимых углеводов проводили на колонке 250 × 4 мм Диасорб-130-АМИН, зернение 6 мкм (“БиоХимМак”), детектор – рефрактометр. Элюент – ацетонитрил : вода (70 : 30), скорость элюирования – 0.6 мл/мин. В качестве стандартных растворов использовали D-Кси, D-Фру, D-мальтозу, D-Гал, D-Глю, Сах, D-раффинозу и др. Количество растворимых углеводов рассчитывали методом абсолютной градуировки. Определения проводили в 3-кратной биологической повторности.

Наличие крахмала идентифицировали при электронно-микроскопических исследованиях клеток хлоренхимы на электронном микроскопе Tesla BS 500 (Чехия) после последовательной фиксации материала в 2.5% глутаральдегиде, 1% водном растворе осмиевой кислоты и смоле Эпон-812. Для анализа использовали не менее 20 ультратонких срезов (микротом Tesla BS 490Å, Чехия). 

Активность перекисного окисления липидов (ПОЛ) оценивали по накоплению в листе ТБК-реагирующих продуктов (ТБК-РП) [17]. Оптическую плотность супернатанта образца регистрировали на спектрофотометре (Shimadzu UY–1700, Япония) при длине волны 532 нм за вычетом неспецифической оптической плотности при 600 нм. Концентрацию (ТБК-РП) рассчитывали с использованием коэффициента молярной экстинкции (ε = 155/(мМ см)). Определения проводили в 3-кратной биологической повторности.

В работе приведены усредненные данные трех независимых серий опытов. В таблицах и на графиках представлены средние арифметические значения и их стандартные ошибки. Все параметры рассчитаны на единицу сухой массы. Данные проанализированы с помощью ANOVA с использованием критерия Дункана при уровне значимости P ˂ 0.05. При характеристике статистической зависимости между двумя числовыми переменными рассчитан коэффициент корреляции Пирсона (r) при уровне значимости P ˂ 0.05. Для статистической обработки использовали программу Statistica 6.1 software (“StatSoft. Inc.”, Tulsa, OK, США). 

 

Результаты

Рост

 

Лист 4-суточных этиолированных проростков характеризовался высокой относительной скоростью роста (ОСР) (рис. 1). Скорость роста листа 5-суточных проростков до начала деэтиоляции составляла 0.022 г/(г сухой массы ч) или 0.5 г/(г сухой массы сутки), что в 1.7 раза ниже по сравнению с 4-суточными. В течение деэтиоляции ОСР листа продолжала снижаться, особенно заметно за первые 2 ч освещения. После 6 ч зеленения величина ОСР листа не превышала 0.009 г/(г сухой массы ч) или 0.22 г/(г сухой массы сутки), а спустя 24 и 48 ч от начала экспозиции на свету составляла около 0.096 и 0.024 г/(г сухой массы сутки) соответственно.

 

Содержание хлорофиллов

Содержание хлорофиллов в процессе деэтиоляции постоянно возрастало и спустя 48 ч воздействия светом достигало 9 мг/г сухой массы. За первые сутки зеленения концентрация хлорофиллов увеличилась в 17 раз, за вторые – в 2 раза (табл. 1). 

 

Скорость видимого фотосинтеза

Скорость видимого фотосинтеза (Фв) первого листа имела отрицательные величины в течение 6 ч деэтиоляции (табл. 1). К концу этого периода отмечали переход к положительным значениям, т.е. скорость поглощения СО2 стала превышать скорости процессов, ведущих к выделению СО2. Через 12 ч деэтиоляции скорость Фв достигала 4 мг CO2/(г сухой массы ч) и в дальнейшем значительно не изменялась.

 

Параметры флуоресценции хлорофилла

Величина Fv/Fm, характеризующая максимальную фотохимическую активность, возрастала в процессе зеленения и достигала значений, характерных для функционально зрелого листа после суток освещения (табл. 1). Показатель фотохимического тушения индуцированной флуоресценции хлорофилла (qP) достигал максимальных значений спустя 6 ч зеленения. Коэффициент нефотохимического тушения (qN) в первые два часа деэтиоляции был низким (меньше 0.4). Максимальные величины qN (0.5–0.6) были зарегистрированы в период 4–12 ч зеленения. Затем следовал небольшой спад активности процессов нефотохимического тушения флуоресценции. 

 

Дыхание и соотношение дыхательных путей

В процессе деэтиоляции дыхание листа, измеренное по скорости выделения СО2 (Дт) и поглощения О2, изменялось однонаправленно, но динамика поглощения О2 была выражена сильнее (рис. 2, табл. 1). В первые 1–2 ч зеленения скорость поглощения О2 в листьях была заметно ниже, чем до начала экспозиции на свету. В последующие 4 ч скорость дыхания увеличилась почти вдвое и к 6 ч деэтиоляции достигла максимального за весь период значения, около 3000 нмоль О2/(г сухой массы мин). К концу 12 ч экспозиции проростков на свету скорость поглощения О2 снижалась в 1.5 раза и поддерживалась на этом уровне до конца эксперимента. 

Изменения скорости поглощения О2 (рис. 2а) были связаны, главным образом, с модуляцией активности АП (Valt) (рис. 2б). Величина Valt листа 4-суточных этиолированных проростков достигала 700 нмоль O2/(г сухой массы мин), а у 5-суточных была на 30% ниже. После включения света скорость Valt листа снизилась вдвое. Максимум активности АП, 1400 нмоль О2/(г сухой массы мин), отмечали спустя 6 ч зеленения. К концу 12-часовой экспозиции проростков на свету скорость Valt снизилась вдвое и в дальнейшем изменялась незначительно. 

Анализ изменения соотношения дыхательных путей в процессе деэтиоляции (рис. 2б) показал, что дыхание этиолированного листа осуществлялось в основном по ЦП (70%). С началом деэтиоляции доля ЦП в дыхании листа снижалась и спустя 46 ч экспозиции проростков на свету стабилизировалась на уровне 50–60%. В отличие от ЦП, вклад АП в дыхание листа возрастал от 25 до 50% в первые 6 ч зеленения, а затем снижался до 30%. 

В другом опыте проростки пшеницы после 6 ч экспозиции на свету вновь помещали в темноту на длительное время (18 ч). После продолжительного темнового периода дыхание первого листа было ниже вдвое, чем до помещения в темноту, и на 25% ниже по сравнению с проростками, непрерывно экспонируемыми на свету (рис. 2а). При этом скорость Valt листа затемненных проростков уменьшалась почти в 3.5 раза, а Vcyt в 1.7 раза (рис. 2б). К концу периода темнового воздействия скорости Valt и Vcyt листа были ниже на 35 и 20% соответственно, чем у экспонируемых на свету проростков.

 

Содержание и состав пула растворимых углеводов

Содержание растворимых углеводов в первом листе 4-суточных этиолированных проростков было довольно высоким и составляло 48% сухой массы (табл. 2). Пул углеводов на 80% состоял из моносахаров. У 5-суточных этиолированных проростков отмечали снижение содержания углеводов почти на 20%, но вклад моносахаров не изменялся. В процессе деэтиоляции концентрация сахаров продолжала постепенно снижаться и к концу экспериментального периода уменьшилась почти вдвое. На протяжении всего этого периода в пуле растворимых сахаров превалировали моносахара (77–85%). На долю дисахаров приходилось не более 10%, но к концу эксперимента, когда полностью исчезали олигосахариды, их доля возрастала до 22%. У первого листа проростков пшеницы, помещенных на длительное время в темноту после 6 ч экспозиции на свету, содержание сахаров снижалось на 35% по отношению к начальной величине. По сравнению с проростками, находившимися на непрерывном свету, листья проростков после длительного затемнения содержали на 18% меньше сахаров. 

 

Наличие крахмала в хлоропластах

Этиопласты 5-суточных проростков содержали крахмальные зерна (табл. 2). В процессе деэтиоляции число пластид, содержащих зерна крахмала, снижалось. Спустя 6 ч зеленения фиксировали отсутствие крахмала, что свидетельствует о полной реутилизации фонда запасенного углерода. 

 

Активность перекисного окисления липидов

Активность перекисного окисления липидов (ПОЛ) в первом листе проростков возрастала в течение 6 ч зеленения до максимальных за весь период значений (табл. 1). Спустя 12 ч на свету содержание ТБК-реагирующих продуктов (ТБК-РП) поддерживалось на высоком уровне, и было вдвое выше, чем в этиолированных листьях. Затем их концентрация снизилась на 25% и сохранялась на этом уровне до конца эксперимента. 

 

Обсуждение

Деэтиоляция – процесс перехода растения от роста в темноте к росту на свету, характеризуется значительными физиолого-биохимическими и морфогенетическими изменениями, в первую очередь, зеленением фототрофных тканей вследствие накопления хлорофилла. Процесс деэтиоляции детально исследован с точки зрения развития хлоропластов и становления фотосинтетической функции, включая аспекты сигнальной регуляции экспрессии ядерных и пластидных генов, кодирующих хлоропластные белки [18]. Сведения об изменении дыхания в процессе зеленения крайне скудны [12, 19]. Вместе с тем, зеленеющие проростки могут служить удобной моделью для выяснения вопросов регуляции дыхания в фотосинтезирующей клетке и анализа связи дыхания с углеводами при переходе растения от гетеротрофного к фототрофному типу питания. 

Мы использовали 5-суточные этиолированные проростки яровой пшеницы, имеющие потенциально высокую способность к деэтиоляции [18]. Изучали функциональные показатели первого листа, развитие которого начиналось в условиях темноты. Все необходимые для роста вещества этиолированные проростки получали из зерновки. К началу экспозиции к свету в зерновке оставалось около 30% запасных веществ (данные не приведены), а этиолированные листья характеризовались высоким содержанием растворимых углеводов (табл. 2). Пластиды первого листа содержали зерна крахмала (табл. 2), образовавшиеся в результате гетеротрофной фиксации углерода [20]. Лист интенсивно рос и активно дышал (рис. 1  2; табл. 1), что указывает на участие дыхания в обеспечении быстро растущих тканей метаболитами и энергией для синтезов de novo. 

Для индукции процесса зеленения проростки были экспонированы на свету. Проростки непрерывно получали 190 мкмоль ФАР/(м2 с) и полностью к нему адаптировались, о чем свидетельствует величина радиации приспособления (ИРП). ИРП определяли графическим способом [15, 21], анализируя световую кривую Фв (рис. 3). Согласно [21], в области ИРП соотношение фотосинтеза и дыхания листа оптимально, а КПД газообмена листа максимально. Заметное снижение дыхательной активности листа этиолированных проростков при переносе их на свет, по-видимому, было обусловлено адаптацией к новым условиям (табл. 1, рис. 2). Следующий за этим подъем дыхательной активности и отрицательный баланс СО2-газообмена свидетельствовали о превалировании в первые 6 ч зеленения процессов декарбоксилирования, связанных с активацией цикла Кребса и, возможно, фотодыхания [22]. Исчезновение крахмальных зерен в развивающихся хлоропластах, по-видимому, обусловлено использованием запасного фонда углерода на рост и дыхание. 

СО2-газообмен первого листа становился положительным после 6 ч экспозиции проростков на свету, когда концентрация хлорофиллов достигла 23 мг/г, а дыхание снизилось (табл. 1, рис. 2). Величина максимального квантового выхода ФС II (Fv/Fm) составляла 0.7, что немногим меньше значений, регистрируемых у функционально зрелого листа. В этот период проростки пшеницы способны к переходу на фототрофный тип питания. Более детально вопросы становления фотосинтетической системы при зеленении проростков пшеницы были рассмотрены нами в работе [23]. 

Процессы фотосинтеза и дыхания у фототрофных тканей на свету тесно скоординированы благодаря существованию сложной сигналлинговой сети. Изменения фонда органического углерода (углеводов, аминокислот) и редокс-состояния клетки в процессе фотосинтетической деятельности влияют на экспрессию генов и активность дыхательных ферментов [7, 24]. В свою очередь, функциональная активность митохондрий на свету обеспечивает поддержание оптимальных для протекания фотосинтеза условий [6, 22]. 

У большинства видов растений лист становится экспортером ассимилятов при достижении им 4060% конечной площади [1, с. 119–120]. К этому времени скорость роста и дыхания листа уже существенно снижались, а скорость фотосинтеза достигала максимума, что обеспечивало положительный баланс углерода. В наших опытах к началу деэтиоляции площадь первого листа пшеницы составляла 6570% и его потребности полностью обеспечивались за счет запасов зерновки. Однако спустя 12 ч зеленения лист уже мог функционировать как донор ассимилятов. Об этом свидетельствует положительный баланс СО2-газообмена, снижение ОСР и убыль фонда растворимых сахаров (табл. 1 и 2, рис. 1). 

Анализ полученных данных показал, что ход дыхания листа в процессе деэтиоляции не зависел от содержания в нем растворимых углеводов (рис. 4а). Изменения активности общего дыхания и АП имели сходный характер, а активность ЦП изменялась независимо от АП (рис. 2). Как и следовало ожидать, активность ЦП тесно коррелировала с ОСР листа (рис. 5) и содержанием в нем растворимых углеводов (рис. 4б). Полученные результаты согласуются с представлениями о том, что в молодых, быстро растущих тканях, фонд углеводов в большей степени используется на энергоемкие процессы роста и развития [1, с. 5862; 25], а цитохромное дыхание является функцией дыхания роста [26]. При смене функции листа на донорную связь между ЦП и содержанием углеводов сохранялась, что отражает потребности в АТФ для поддержания функциональной целостности и активности существующих структур, включая реализацию донорной функции листа. Другими словами, в широком диапазоне концентраций углеводов активность ЦП первого листа зеленеющих проростков пшеницы эффективно регулируется механизмом дыхательного контроля в соответствии с энергетическими нуждами клетки. 

Мы не выявили прямой зависимости АП от ОСР листа (рис. 5). Связь АП и содержания углеводов также не могла быть описана какой-либо одной функцией (рис. 4б). Активность АП первого листа возрастала значительно на фоне снижения содержания растворимых углеводов в первые 6 ч экспозиции проростков на свету. Важно отметить, что в период, соответствующий 6 ч зеленения, скорость АП дыхания была сопоставима со скоростью ЦП. С переходом листа к донорной функции величина Valt снижалась сильнее, чем Vcyt. Если зеленеющие проростки помещали в темноту на длительное время, то активность АП уменьшалась на фоне исчерпания фонда растворимых углеводов. Возможно, это свидетельствует о субстратной регуляции АП, что было ранее продемонстрировано другими авторами [12]. Однако на начальных этапах зеленения (0–2 ч) активность АП листа была существенно ниже, несмотря на высокое содержание растворимых углеводов и присутствие запасного крахмала. 

По-видимому, вовлечение АП в процессы роста и зеленения листа контролируется несколькими факторами. Поддержание интенсивного роста в темноте за счет запасов семени (рис. 1) сопряжено с необходимостью бесперебойной поставки метаболитов ЦТК для синтезов de novo. Участие АП в окислении части образующегося в цикле Кребса НАД·Н позволяет не только обеспечить высокую активность цикла, но и предотвращает образование избыточного количества АФК в митохондриях [4, 22]. В фототрофных клетках основным источником образования АФК считаются хлоропласты. В условиях повышенной освещенности усиление активности АО в листьях некоторых видов растений происходило на фоне увеличения концентрации сахаров, АТФ и степени восстановленности пула убихинона, что, по мнению авторов [8, 9], способствовало защите от фотоокислительного стресса и поддержанию редокс-статуса фотосинтезирующих клеток.

Мы проанализировали связь АП дыхания первого листа проростков пшеницы с изменением содержания ТБК-реагирующих продуктов, уровень накопления которых отражает активность перекисного окисления липидов (ПОЛ) живой клетки кислородными радикалами. Как видно на рис. 6, корреляция между активностью АП и уровнем ПОЛ была слабой (рис. 6). Следовательно, функция АП не сводится только к предотвращению избыточного накопления АФК, что согласуется с мнением других авторов [19, 27]. Данные табл. 1 показывают, что уровень ПОЛ и qN в процессе деэтиоляции первого листа проростков пшеницы изменялись синхронно. Это указывает на эффективность фотопротекторных механизмов, препятствующих избыточному образованию АФК в хлоропластах. 

В донорном листе с ограниченной доступностью субстрата для дыхания, влияние углеводов на вовлечение АП возможно путем аллостерической регуляции активности альтернативной оксидазы. Известно, что такой механизм приводит к распаду сахарозы до пирувата, активирующего АО и увеличивающего сродство фермента к убихинону [28]. В обзорах [29, 30] говорится, что такая ситуация может возникнуть в результате снижения пропускной способности ЦП при действии фосфат-акцепторного контроля. Наши данные показали, что с переходом к донорной функции и снижением фонда сахаров активность АП и ЦП дыхания в первом листе проростков пшеницы изменялись сходным образом. Причем скорость АП была в 1.5 раза ниже скорости ЦП. Однако уменьшение фонда сахаров при длительном выдерживании зеленеющих проростков в темноте сильнее тормозило АП, чем ЦП. 

Таким образом, нами выявлены закономерности изменения дыхания и соотношения дыхательных путей в процессе деэтиоляции и становления фотосинтетической функции первого листа проростков пшеницы. Ход дыхания листа был связан с модуляцией активности альтернативного пути. Установлено наличие тесной зависимости цитохромного пути дыхания от содержания углеводов и скорости роста. Это позволяет заключить, что регуляция активности ЦП количеством субстрата опосредована энергоемкими процессами роста и эффективно осуществляется с помощью механизма дыхательного контроля. Активность АП в процессе деэтиоляции изменялась независимо от содержания растворимых углеводов. Это указывает на существование, помимо субстратного, других более сложных механизмов, регулирующих вовлечение альтернативного пути дыхания. Результаты нашей работы свидетельствуют в пользу представлений об участии альтернативного пути дыхания в поддержании гомеостаза фотосинтезирующей клетки в период становления фотосинтетической функции. 

Авторы благодарят к.б.н. С.Н. Плюснину за электронно-микроскопические исследования клеток мезофилла листа. 

Работа поддержана грантом Уральского отделения РАН № 12-У-4-1008. 

 

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1.Головко Т.К. Дыхание растений (физиологические аспекты). С.-Петербург: Наука, 1999. 204 с. 

2.Lambers H., Robinson S.A., Ribas-Carbo M. Chapter 1. Regulation of respiration in vivo // Plant Respiration: from Cell to Ecosystem / Ed. Lambers H., Ribas-Carbo M. Dordrecht: Springer, 2005. P. 63-83.

3.Lambers H. Cyanide-resistant respiration: a non-phosphorylating electron transport pathway acting as an energy overflow // Physiol. Plant. 1982. V. 55. P. 478–485.

4.Millenaar F.F., Lambers H. The alternative oxidase: in vivo regulation and function // Plant Biol. 2003. V. 5. P. 2–15.

5.Maxwell D.P., Wang Y., McIntosh L. The alternative oxidase lowers mitochondrial reactive oxygen production in plant cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. P. 8271–8276.

6.Noguchi K., Yoshida K. Interaction between photosynthesis and respiration in illuminated leaves // Mitochondrion. 2008. V. 8. P. 887899.

7.Rasmusson A.G., Escobar M.A. Light and diurnal regulation of plant respiratory gene expression // Physiol. Plant. 2007. V. 129. P. 5767.

8.Noguchi K., Terashima I. Different regulation of leaf respiration between Spinacia oleracea, a sun species, and Alocasia odora, a shade species // Physiol. Plant. 1997. V. 101. P. 17.

9.Noguchi K., Go C.S., Terashima I., Ueda S., Yoshinari T. Activities of the cyanide-resistant respiratory pathway in leaves of sun and shade species // Aust. J. Plant Physiol. 2001. V. 28. P. 27–35.

10.Florez-Sarasa I., Ostaszewska M., Galle A., Flexas J., Rychter A.M., Ribas-Carbo M. Changes of alternative oxidase activity, capacity and protein content in leaves of Cucumis sativus wild-type and MSC16 mutant grown under different light intensities // Physiol. Plant. 2009. V. 137. P. 419426.

11.Головко Т.К., Пыстина Н.В. Альтернативный путь дыхания в листьях Rhodiola rosea L. и Ajuga reptans L.: возможная физиологическая роль // Физиология растений. 2001. Т. 48. С. 846–853.

12.Ribas-Carbo M., Robinson S.A., González-Meler M.A., Lennon A.M., Giles L, Siedow J.N., Berry J.A. Effects of light on respiration and oxygen isotope fractionation in soybean cotyledons // Plant Cell Environ. 2000. V. 23. P. 983–989.

13.Bewley J.D., Hempel F.D. McCormick S., Zambryski P. Reproductive development // Biochemistry and Molecular Biology of Plants. Ch. 19 / Eds. Buchanan B.B., Gruissem W., Jones R.L. Rockville, Maryland: American Society of Plant Physiologists, 2000. P. 988–1043.

14.Radford P.J. Growth analysis formulae – their use and abuse // Crop Sci. 1967. V. 7. P. 171–175.

15.Гармаш Е.В., Головко Т.К. СО2-газообмен и рост Rhaponticum carthamoides (Willd.) Iljin в условиях подзоны средней тайги европейского Северо-Востока. 1. Зависимость фотосинтеза и дыхания от внешних факторов // Физиология растений. 1997. Т. 44. С. 854–863.

16.Møller I.M., Bérczi A., van der Plas L.H.W., Lambers H. Measurement of the activity and capacity of the alternative pathway in intact plant tissues: identification of problems and possible solutions // Physiol. Plant. 1988. V. 72. P. 642649.

17.Heath R.L., Packer L. Photoperoxidation in isolated chloroplasts. I. Kinetics and stoichiometry of fatty acids peroxidation // Arch. Biochem. Biophys. 1968. V. 125. P. 189–198.

18.Kravtsov A.K., Zubo Y.O., Yamburenko M.V., Kulaeva O.N., Kusnetsov V.V. Cytokinin and abscisic acid control plastid gene transcription during barley seedling de-etiolation // Plant Growth Regul. 2011. V. 64. P. 173–183.

19.Feng H.Q., Li H.Y., Zhou G.M., Liang H.G., Duan J.G., Zhi D.J., Li X., Ma J. Influence of irradiation on cyanide-resistant respiration and AOX1 multi-gene family expression during greening of etiolated rice seedlings // Photosynthetica. 2007. V. 45. P. 272279.

20.Neuhaus H.E., Emes M.J. Nonphotosynthetic metabolism in plastids // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 2000. V. 51. P. 111–140.

21.Тооминг Х.Г. Экологические принципы максимальной продуктивности посевов. Ленинград: Гидрометеоиздат, 1984. 246 с.

22.Nunes-Nesi A., Sweetlove L.J., Fernie A.R. Operation and function of the tricarboxylic cycle in the illuminated leaf // Physiol. Plant. 2007. V. 129. P. 45–56.

23.Garmash E.V., Dymova O.V., Malyshev R.V., Plyusnina S.N., Golovko T.K. Developmental changes in energy dissipation in etiolated wheat seedlings during the greening process // Photosynthetica. 2013. V. 51. doi 10.1007/s11099-013-0044-z

24.Мамушина Н.С., Зубкова Е.К., Войцеховская О.В. Взаимодействие фотосинтеза и дыхания у одноклеточных водорослей и С3-растений // Физиология растений. 1997. Т. 44. С. 449461.

25.Gonzàlez-Meler M.A., Giles L., Thomas R.B., Siedow J.N. Metabolic regulation of leaf respiration and alternative pathway activity in response to phosphate supply // Plant Cell Environ. 2001. V. 24. P. 205215.

26.Florez-Sarasa I.D., Bouma T.J., Medrano H., Azcon-Bieto J., Ribas-Carbo M. Contribution of the cytochrome and alternative pathways to growth respiration and maintenance respiration in Arabidopsis thaliana // Physiol. Plant. 2007. V. 129. P. 143–151.

27.Fiorani F., Umbach A.L., Siedow J.N. The alternative oxidase of plant mitochondria is involved in the acclimation of shoot growth at low temperature. A study of Arabidopsis AOX1a transgenic plants // Plant Physiol. 2005. V. 139. P. 1795–1805.

28.Vanlerberghe G.C., Day D.A., Wiskich J.T., Vanlerberghe A.E., McIntosh L. Alternative oxidase activity in tobacco leaf mitochondria: dependence on tricarboxylic acid cycle-mediated redox regulation and pyruvate activation // Plant Physiol. 1995. V. 109. P. 353–361.

29.Шугаев А.Г. Альтернативная CN-резистентная оксидаза митохондрий растений: структурная организация, механизмы регуляции активности, возможная физиологическая роль // Физиология растений. 1999. Т. 46. С. 307320.

30.Noguchi K. Effects of light intensity and carbohydrate status on leaf and root respiration // Plant Respiration: From Cell to Ecosystem. Ch. 5 / Eds. Lambers H., Ribas-Carbo M. Dordrecht: Springer, 2005. P. 6383.

 

Таблица 1. Содержание хлорофиллов (Хл), параметры индуцированной флуоресценции хлорофилла (Fv/Fm, qP, qN), скорость видимого фотосинтеза (Фв), темнового дыхания (Дт) и содержание ТБК-реагирующих продуктов (ТБК-РП) в листе проростков пшеницы в процессе их деэтиоляции

 

Примечание. Представлены среднеарифметические величины и их стандартные ошибки из трех независимых серий опытов. В каждом опыте для Fv/Fm, qN, qP n = 5–12; для Фв, Дт n = 6–8; для содержания Хл n = 5, для ТБК-РП n = 3. Разные надстрочные символы обозначают достоверность изменений параметра в процессе деэтиоляции (ANOVA, тест Дункана, p ˂ 0.05). Прочерк – отсутствие данных. 

 

Таблица 2. Состав и содержание неструктурных углеводов и крахмала в листе проростков пшеницы в процессе их деэтиоляции и после длительного выдерживания зеленеющих проростков (после 6 ч деэтиоляции) в темноте (18 ч)

 

 

 

ПОДПИСИ К РИСУНКАМ

 

Рис. 1. Относительная скорость роста (ОСР) первого листа проростков пшеницы.

Представлены среднеарифметические величины и их стандартные ошибки из трех независимых серий опытов. В каждом опыте n = 20. Разные надстрочные символы обозначают достоверность изменений параметра в процессе деэтиоляции (ANOVA, тест Дункана, p ˂ 0.05). 

 

Рис. 2. Активность общего (а), цитохромного (Vcyt) и альтернативного пути дыхания (Valt) (б) в листе проростков пшеницы в процессе их деэтиоляции. 

Штриховая линия обозначает снижение скорости дыхания после длительного (18 ч) выдерживания проростков в темноте. В каждом опыте n = 6–8. Остальные обозначения, как на рис. 1.

 

Рис. 3. Световая кривая нетто-фотосинтеза интактного листа 7-дневных проростков пшеницы после 48 ч деэтиоляции. 

Представлены среднеарифметические величины и их стандартные ошибки из трех независимых серий опытов. В каждом опыте n = 6–8.

 

Рис. 4. Связь активности общего (а), цитохромного (белый символ) и альтернативного дыхания (серый символ) (б) с содержанием неструктурных углеводов в листе проростков пшеницы в процессе их деэтиоляции. 

Представлены среднеарифметические величины и их стандартные ошибки из трех независимых серий опытов. В каждом опыте для скорости поглощения О2 n = 6–8, содержания углеводов n = 3.

 

Рис. 5. Связь активности цитохромного (белый символ) и альтернативного дыхания листа (серый символ) с относительной скоростью роста проростков пшеницы (ОСР) в процессе их деэтиоляции.

Представлены среднеарифметические величины и их стандартные ошибки из трех независимых серий опытов. В каждом опыте для скорости поглощения О2 n = 6–8, для ОСР n = 20.

 

Рис. 6. Активность альтернативного дыхания и перекисного окисления липидов в листе проростков пшеницы в процессе их деэтиоляции. 

Представлены среднеарифметические величины и их стандартные ошибки из трех независимых серий опытов. В каждом опыте для скорости поглощения О2 n = 6–8, содержания ТБК-РП n = 3.