УДК 581.1

УСТАНОВКА ДЛЯ ИЗМЕРЕНИЙ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ ХЛОРОФИЛЛА, 

СО2-ГАЗООБМЕНА И ТРАНСПИРАЦИИ ОТДЕЛЁННОГО ЛИСТА

© 2014 г. П. Ю. Воронин

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки 

Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Москва

Поступила в редакцию 27.03.2013 г.

 

На примере оригинальной экспериментальной установки проанализирован блочный принцип конструкции открытой СО22О-газоизмерительной, комбинированной с флуориметром, современной системы для изучения дыхания, световой и темновой стадий фотосинтеза и транспирации отделенного листа.

 

Ключевые слова: высшее растение – лист – фотосинтетический СО22О-газообмен – дыхание – флуоресценция хлорофилла

 

-----------------------------------

Адрес для корреспонденции: Воронин Павел Юрьевич. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН. Электронная почта: pavel@ippras.ru

 

ВВЕДЕНИЕ

Более полувековая практика применения оптико-акустического принципа измерения содержания СО2 в газовых смесях произвела переворот в методике изучения фотосинтетического газообмена и существенно обогатила наши знания о нем. Широкое использование инфракрасных (ИК) газоанализаторов в экспериментальной работе стимулировало разработку и усовершенствование листовых камер [1–3] и систем калибровки ИК-газоанализаторов [4–7]. Последнее в свою очередь повлекло за собой решение задачи кондиционирования газовых смесей и переход от метода наблюдения за ходом газообмена листа к активному физиологическому эксперименту, нацеленному на вскрытие физиолого-биохимической сущности фотосинтетического газообмена [8]. Разработка формализованных моделей фотосинтетического газообмена листа стала методом его количественного описания [9, 10]. На современном этапе развития науки эти модели были положены в основу проектирования приборов, алгоритмов измерительных процедур и расчетных показателей для изучения фотосинтеза.

Настоящая работа на примере оригинальной установки сфокусирована на анализе конструкционных особенностей блочной компоновки газоизмерительных систем для изучения фотосинтетического СО2/Н2О-газообмена в комбинации с методом амплитудно-модулированной импульсной (PAM) флуориметрии для изучения темновой и световой стадий фотосинтеза листа in situ.

 

ОСНОВНЫЕ УЗЛЫ ГАЗОИЗМЕРИТЕЛЬНОЙ СИСТЕМЫ ОТКРЫТОГО ТИПА

Первым элементом газоизмерительной системы по ходу движения газа является газгольдер (рис. 1). Газгольдер представляет собой герметично запаянный со всех сторон легкий полиэтиленовый конверт. В один из углов этого конверта вставлена и герметично уплотнена резиновая пробка со штуцером в виде отрезка тонкостенной стальной трубки диаметром около 3 мм. Емкость газгольдера в ненапряженном состоянии составляет около 30 л. При скорости подачи газа в газоизмерительную систему (100 мл/мин) c помощью мембранного насоса запаса газа в газгольдере хватает на 5 ч работы. После насоса расположен демпфирующая колебания давления герметичная пластиковая емкость объемом около 300 мл.

За демпфирующей емкостью находится блок настройки понижения концентрации СО2. Блок настройки понижения концентрации СО2 представляет собой разветвление газового тракта после демпфирующей емкости на два рукава. В одном сегменте установлены последовательно регулировочный газовый кран и патрон с поглотителем СО2 (например, с гранулированным NaOH). Поток газа из газгольдера в другом рукаве газового тракта регулируется с помощью игольчатого крана. На входе в блок увлажнения очищенный от СО2 газ и исходный опорный поток из газгольдера объединяются. Поэтому при необходимости на вход увлажнителя можно подавать поток газа с пониженной до нужной величины концентрацией СО2.

Блок кондиционирования влажности опорного газа представляет собой необходимый элемент газоизмерительной системы. Действительно, влажностный режим в листовой камере является одним из параметров, определяющих устьичное сопротивление листа газообмену. Кроме того, возможность точного кондиционирования опорного газа парами воды в разной концентрации позволяет разнообразить спектр факторов экспериментального воздействия на фотосинтетический газообмен. В случае описываемой здесь установки увлажненный при помощи LI-610 (“LI-COR”, США) опорный газ подается в листовую камеру.

Конструкция быстродействующей листовой камеры была подробно описана ранее [2]. Сопутствующими ей узлами являются блок температурного кондиционирования и система электромагнитных клапанов, позволяющая автоматически произвольно коммутировать три пары вход-выход из листовой камеры в той или иной конфигурации в зависимости от целей конкретного эксперимента. Особенности изменения СО2/Н2О-газообмена отделенного листа со временем были освещены нами ранее [11].

ИК-газоанализатор является центральным блоком измерительной системы. В основе действия ИК-газоанлизатора лежит принцип избирательного поглощения молекул СО2 в узкой оптической полосе ИК-диапазона. В данной установке использован одноканальный ИК-газоанализатор LI-820 (“LI-COR”). Эту модель отличает высокая СО2-избирательность фильтрации ИК-излучения, позволяющая исключить влияние на полезный сигнал присутствия в газовой смеси водяных паров и других поглощающих в ИК-диапазоне газов. Дополнительным достоинством данного прибора является возможность измерять давление в газовом тракте. В случае подсоединения газоанализатора непосредственно к выходу листовой камеры это свойство позволяет отслеживать изменения давления в листовой камере по ходу эксперимента. 

В большинстве коммерческих газоизмерительных систем применяют двухканальные ИК-газоанализаторы, исходя из того, что чувствительность такой схемы включения газоанализатора увеличивает чувствительность и точность измерения полезного сигнала. Использование двухканального ИК-газоанализатора в схеме, где через один канал пропускается опорный газ, а через второй – газ с выхода листовой камеры позволяет нивелировать колебания концентрации СО2 и давления в опорном газе в том случае, если в газовую систему направляется воздух из атмосферы. Однако тогда возникает проблема компенсации независимого дрейфа “нулей” детекторов сигнала в двух измерительных каналах. 

В случае одноканального газоанализатора учет и компенсация дрейфа “нуля” единственного детектора сигнала существенно упрощается. Дрейф “нуля” детектора может быть учтен путем измерения концентрации СО2 в опорном газе до и после эксперимента или по схеме обхода листовой камеры газовой линией. Собственно так же в схеме обхода газовым потоком листовой камеры нивелируется дрейф “нуля” двух детекторов в случае двухканальной газоизмерительной схемы. Колебаний давления в листовой камере и постоянства концентрации СО2 в опорном газе можно избежать включением после компрессора демпфирующих емкостей и использованием предварительно кондиционированного газа. К достоинству одноканальной схемы относится возможность контролировать значение абсолютной концентрации СО2 на входе и на выходе из листовой камеры с постоянной точностью. Критичными в одноканальной схеме измерения СО2 являются точность самого ИК-газоанализатора, постоянство давления в газовой камере и концентрации СО2 в опорном газе. Кроме того, следует отметить существенно более низкую стоимость одноканальных ИК-газоанализаторов по сравнению с двухканальными.

Блок измерения влажности. Традиционным датчиком определения влажности в газовом тракте является психрометр на основе термопары [6; 8, c. 57]. В ряде случаев для этих целей также используют ИК-газоанализаторы, настроенные избирательно на оптическую полосу поглощения ИК-радиации молекулой Н2О. Однако применение психрометрического метода существенно дешевле и потому может быть рекомендовано в качестве предпочтительного способа в недорогих газоизмерительных системах. В описываемой здесь установке для определения влажности и температуры в блоке измерения влажности использовали психрометрический датчик HMP50 (“Vaisala INTERCAP”, Финляндия).

Блок расхода газа БГ-105 (OOO “Цвет”, Россия), примененный в нашей газоизмерительной системе, относится к тепловым расходомерам неконтактного типа. Эти расходомеры измеряют массовый расход газа, поэтому их показания не зависят от давления газа. В нашей газоизмерительной схеме обычно поддерживался расход газа со скоростью 100 мл/мин.

Плотность квантов светового потока в области ФАР измеряли с помощью квантометра LI-190SB (“LI-COR”).

Блок освещения и измерения флуоресценции хлорофилла. Лист в камере освещали с помощью оптоволоконного световода с диаметром светового пучка 35 мм. В качестве источника света применяли галогеновую лампу FO 6423 150 Вт (“Philips”, Германия). На уровне поверхности листа создавали плотность светового потока квантов ФАР (PPFD) 1200 мкмоль/(м2 с). Использование оптоволоконного световода позволило эффективно снять тепловую компоненту источника освещения и, тем самым, избежать избыточного по отношению к температуре в камере нагрева листа. Для определения темнового выхода флуоресценции хлорофилла ФС II использовали флуориметр PAM-101 (“Walz”, Германия).

Устройства регистрации и вывода измеряемых показателей. Сигнал от датчиков влажности, температуры, освещенности и ИК-газоанализатора по ходу эксперимента записывали в память аналого-цифрового преобразователя LI-1400 datalogger (“LI-COR”). По окончании опыта эти данные через последовательный порт вывода RS-232, используя фирменное программное обеспечение “LI-COR”, записывали на жесткий диск персонального компьютера. Для удобства контроля за изменением концентрации СО2 в листовой камере во время эксперимента аналоговый сигнал от ИК-газоанализатора через последовательный порт вывода, также используя программное обеспечение “LI-COR”, передавали на монитор персонального компьютера (ПК) в графическом виде. Запись временных изменений концентрации СО2 в листовой камере по ходу эксперимента сохраняли в виде графического файла. 

Сигнал флуоресценции хлорофилла возбуждали в листе и отводили от листовой камеры к флуориметру PAM 101 при помощи гибкого оптоволоконного световода Fiberoptics 101F (“Walz”). Полезный сигнал передавали на ПК через последовательный порт RS-232, используя аналого-цифровой преобразователь PDA-100 (“Walz”). Оригинальную запись временнόго хода изменения флуоресценции и всех расчетных параметров выводили на монитор ПК в режиме реального времени. Результаты расчетов характеристических показателей флуоресценции формировались программным обеспечением “Walz” в файл протокола эксперимента.

Определяемым показателем флуоресценции хлорофилла ФС II был F/Fm – максимальная квантовая эффективность фотохимического преобразования ФС II (Yield) адаптированного к темноте листа. Расчет данного показателя флуоресценции адаптированного к темноте листа по ходу измерений осуществлялся с помощью программного обеспечения “Walz” по формуле [12]:

F/Fm = (Fm – F0)/Fm,

где Fm – максимальная флуоресценция, F0 – минимальная флуоресценция.

 

КОМПОНОВКА БЛОКОВ ГАЗОИЗМЕРИТЕЛЬНОЙ СИСТЕМЫ ОТКРЫТОГО ТИПА

Исторически предпочтение получила открытая схема компоновки газоизмерительной системы (рис. 1). Это обусловлено, прежде всего, необходимостью создания факторостатных условий в листовой камере. Поскольку для измерения изменений газового состава в листовой камере необходима наибольшая точность и быстрота, то следующим блоком после камеры должен быть сам ИК-газоанализатор. Применение современных ИК-газоанализаторов с селективной чувствительностью к излучению в ИК-диапазоне поглощения СО2 позволяет избежать потери быстродействия, связанной с предварительной сушкой газа из листовой камеры. Вследствие этого появляется возможность с помощью психрометра измерять транспирационный поток Н2О из листа на выходе из ИК-газоанализатора. 

Может возникнуть вопрос о причине приоритетного размещения именно ИК-газоанализатора непосредственно после листовой камеры, а не психрометра, измеряющего транспирацию. Причина предпочтения именно СО2-газоанализа в качестве более приоритетной измерительной процедуры состоит в том, что биохимические процессы СО2-газообмена – значительно более быстрый процесс по сравнению с движением устьиц, определяющим изменение транспирации. Последним к концу газового тракта располагается блок измерения расхода газа. 

Газовая система в рабочем состоянии находится под небольшим избыточным давлением, уровень которого создается компрессором на входе в газовый тракт и контролируется с помощью расположенного после компрессора поплавкового расходомера по показаниям встроенного в ИК-газоанализатор датчика давления. Использование компрессора оправдано тем, что система в целом работает при низком избыточном давлении. Применение сжатого газа из баллона в качестве побудителя движения газа в случае недостаточно аккуратных действий оператора связано с риском “броска” высокого давления. В данной газовой схеме отказались от системы водяных маностатов, которые выравнивают перепады давления на концах газосмесительных капилляров, но использование, которых сопровождается риском “залить” систему в случае резкого падения давления на входе в систему. Решением проблемы кондиционирования опорного газа стало разделение процедур приготовления газовой смеси нужного состава и ее подачи в газоизмерительную систему. Для этой цели применили обычную процедуру предварительного приготовления газовых смесей в газгольдере, точно так, как это делают в экспериментах с изучением фотосинтетической ассимиляции 14СО2. В этом случае поочередно, через один и тот же расходомер, подавали сжатый азот и углекислый газ из баллонов в легкий герметичный полиэтиленовый пакет емкостью около 30 литров. Необходимую концентрацию кислорода в газгольдере получали в результате смешивания атмосферного воздуха и азота. В эту смесь, с помощью того же самого поплавкового расходомера, вводили необходимое количество углекислого газа из баллона. Точную окончательную настройку-понижение концентрации СО2, подаваемого в листовую камеру, осуществляли с помощью блока кондиционирования концентрации СО2 газо-измерительной системы. Поверку и настройку ИК-газоанализатора выполняли с помощью коммерческих калибровочных газовых смесей СО2 и азота.

 

ИЗМЕРЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ СВЕТОВОЙ, ТЕМНОВОЙ СТАДИЙ ФОТОСИНТЕЗА И ТРАНСПИРАЦИИ ЛИСТА

Эксперимент начинали с мониторинга СО2 в опорном газе, подаваемого компрессором из газгольдера, до момента выхода концентрации двуокиси углерода на стационарный уровень (рис. 2). Эта концентрация СО2 в опорном газе служила базой, от которой вели отсчет при переходе газообмена листа в некоторый, задаваемый экспериментально, стационарный режим. Свежесрезанный лист помещали в листовую камеру и в токе опорного газа в течение 10–15 мин адаптировали к темноте. После этого с помощью PAM флуориметра измеряли квантовый выход ФС II и стационарное значение концентрации СО2, соответствующее дыханию листа в темноте. Впоследствии на основании измерений скорости газового потока (мл/мин) блоком расхода газа, разницы стационарных значений концентрации СО2 (мкмоль/л) в опорном газе и в газовом потоке на выходе из листовой камеры обычным способом рассчитывали значение СО2-газообмена листа [4]. Затем лист освещали и по показанию датчика влажности дожидались открывания устьиц. После выхода показаний ИК-газоанализатора на стационарный уровень текущее значение концентрации СО2 заносили в протокол опыта. Таким образом, в открытой газоизмерительной системе определяли фотосинтез как разницу значений концентрации СО2 в опорном газе на выходе из листовой камеры в двух стационарных режимах: без листа и с листом на свету (рис. 3). Дыхание определяли по той же схеме, но только без освещения листа.

В некоторых экспериментальных условиях листья могут обладать низкой проводимостью газообмена, т.е. высоким устьичным сопротивлением. Такое состояние листа при нормальной атмосферной концентрации СО2 означает лимитирование СО2/Н2О-газообмена устьицами и не позволяет достоверно оценить различия темновой стадии фотосинтеза между опытным и контрольным вариантами опыта. Данное затруднение можно преодолеть, измеряя СО2-газообмен при пониженной примерно вдвое концентрации СО2. С помощью блока настройки понижения концентрации СО2 нашей установки уровень двуокиси углерода в газовом тракте на входе в листовую камеру понижали вдвое (рис. 2). В этом случае достигнутое в ходе эксперимента стационарное значение СО2-газообмена освещенного листа позволяет выявить специфику процессов в центрах карбоксилирования в опытном и контрольном вариантах. Существенно, что измерения транспирации при нормальной и “половинной” концентрации СО2 в опорном газе характеризуют участие устьиц в эффекте опытного воздействия на лист. После этого листовую камеру снова затемняли светонепроницаемой шторкой и по выходу показаний датчика влажности и ИК-газоанализатора на стационарный уровень выдерживали время, необходимое для адаптации листа к темноте. Затем измеряли темновой выход флуоресценции хлорофилла ФС II при 50% от атмосферной концентрации СО2. Данные этого этапа измерительной процедуры позволяли оценить функциональное состояние световой стадии фотосинтеза листа в условиях пониженной, по сравнению с атмосферной, концентрации СО2 в листовой камере. На завершающей стадии эксперимента лист извлекали из камеры и измеряли концентрацию СО2 в опорном газе (рис. 2).

Таким образом, применение описанной выше измерительной схемы позволяет при действии внешнего фактора в опытном варианте оценить вклад световой и темновой стадий фотосинтеза, а также устьичного сопротивления листа в наблюдаемый СО2/Н2О-газообмен.

Работа выполнена частично за счет средств проекта 4.3; направление 4 “Воздействие экстремальных природных явлений и техногенных катастроф на почвенный покров, лесные и болотные экосистемы” Программы Президиума РАН “Оценка и пути снижения негативных последствий экстремальных природных явлений и техногенных катастроф, включая проблемы ускоренного развития атомной энергетики”.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1.Оя В.М. Быстродействующая газометрическая установка для исследования кинетики фотосинтеза листьев // Физиология растений. 1983. Т. 30. С. 1045–1052.

2.Пярник Т.Р., Кээрберг О.Ф., Юрисма Э.Я. Быстродействующая экспозиционная камера для изучения фотосинтеза при помощи 14СО2 // Физиология растений. 1983. Т. 34. С. 837–845.

3.Laisk A., Kiirats O., Eichelmann H., Oja V. Gas exchange studies of carboxylation kinetics in intact leaves // Photosynthesis In Silico: Understanding Complexity from Molecules to Ecosystems. V. 29. Ser. Advances in Photosynthesis and Respiration / Eds. Laisk A., Nedbal L., and Govindjee. Berlin; Heidelberg: Springer-Verlag, 2009. P. 151–162.

4.Вознесенский В.Л. Использование СО2-газоанализаторов в полевых исследованиях газообмена и его составляющих у растений // Инфракрасные газоанализаторы в изучении газообмена растений / Под ред. Ничипоровича А.А. Москва: Наука, 1990. С. 6–19.

5.Щербатюк А.С. Многоканальные установки с СО2-газоанализаторами для лабораторных и полевых исследований // Инфракрасные газоанализаторы в изучении газообмена растений / Под ред. Ничипоровича А.А. Москва: Наука, 1990. С. 38–54.

6.Сивков М.Д., Назаров С.К. Одноканальная газометрическая установка для измерения фотосинтеза и транспирации растений в полевых условиях // Инфракрасные газоанализаторы в изучении газообмена растений / Под ред. Ничипоровича А.А. Москва: Наука, 1990. С. 55–64.

7.Рожковский А.Д. Простой метод градуировки инфракрасного газоанализатора // Инфракрасные газоанализаторы в изучении газообмена растений / Под ред. Ничипоровича А.А. Москва: Наука, 1990. С. 107–115.

8.Лайск А.Х. Кинетика фотосинтеза и фотодыхания С3-растений. Москва: Наука, 1977. 156 с.

9.Von Caemmerer S., Farquhar G., Berry J. Biochemical model of C3 photosynthesis // Photosynthesis In Silico. Understanding Complexity from Molecules to Ecosystems. V. 29. Ser. Advances in Photosynthesis and Respiration / Eds. Laisk A., Nedbal L., Govindjee. Berlin; Heidelberg: Springer-Verlag, 2009. P. 209–230.

10.Laisk A., Eichelmann H., Oja V. Leaf C3 photosynthesis in silico: Integrated Carbon/Nitrogen Metabolism // Photosynthesis In Silico. Understanding Complexity from Molecules to Ecosystems. V. 29. Ser. Advances in Photosynthesis and Respiration / Eds. Laisk A., Nedbal L., Govindjee. Berlin; Heidelberg: Springer-Verlag, 2009. P. 295–322.

11.Воронин П.Ю., Федосеева Г.П. Устьичный контроль фотосинтеза у отделенных листьев древесных и травянистых растений // Физиология растений. 2012. Т. 59. С. 309–315.

12.Schreiber U. Chlorophyll Fluorescence and Photosynthetic Energy Conversion: Simple Introductory Experiments with the TEACHING-PAM Chlorophyll Fluorometer. Effeltrich: Heinz Walz GmbH, 1997. 73 p.

ПОДПИСИ К РИСУНКАМ

 

Рис. 1. Блок-схема установки для изучения флуоресценции хлорофилла, СО2-газообмена и транспирации листа. 

1 – газгольдер, 2 – мембранный компрессор, 3 – поплавковый ротаметр, 4 – демпфирующая емкость, 5 – блок настройки понижения концентрации СО2, 6 – блок кондиционирования влажности опорного газа, 7 – быстродействующая экспозиционная камера, 8 – ИК-газоанализатор, 9 – блок измерения влажности, 10 – блок расхода газа, 11 – датчик кислорода, 12 – флуориметр, 13 – источник света, 14 – оптоволоконные световоды. Стрелкой указано направление движения газа.

 

Рис. 2. Оригинальная запись измеренного с помощью ИК-газоанализатора LI-820 временнόго хода концентрации СО2 в камере без листа при переключении между двумя стационарными режимами газового потока. 

1 – при исходной концентрации СО2 в газгольдере, 2 – при уменьшении концентрации СО2 с помощью блока настройки понижения СО2. Стрелками отмечены моменты включения блока настройки концентрации СО2 на понижение (стрелка вниз) и на возврат (стрелка вверх) к исходной концентрации СО2. 

 

Рис. 3. Динамика концентрации СО2 в газовом потоке на выходе из листовой камеры после освещения листа 8-дневного проростка кукурузы. 

Стрелками отмечено начало освещения листа в камере (стрелка вниз) и момент выхода фотосинтеза листа в газовом потоке на стационарный режим (стрелка вверх).