УДК 581.1

ЭПИГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ У РАСТЕНИЙ: НАСЛЕДУЕМОСТЬ, АДАПТИВНОСТЬ, ЭВОЛЮЦИОННОЕ ЗНАЧЕНИЕ

© 2016 г. В. В. Ашапкин, Л. И. Кутуева, Б. Ф. Ванюшин

Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва

Поступила в редакцию 30.06.2015 г.

Метилирование ДНК является самой стабильной эпигенетической модификацией с хорошо изученным механизмом поддержания в поколениях митотически делящихся клеток. ДНК растений метилируется по сайтам трех типов: CG, CHG и CHH. Механизмы метилирования этих сайтов различны и включают функциональную активность разных ДНК-метилтрансфераз и вспомогательных факторов, во многом определяющих специфичность метилирования локусов генома. Характер метилирования генома, ДНК-метилом, у растений наследуется не только в поколениях делящихся клеток, но и в очень значительной степени в поколениях целых растений. Известно множество спонтанных природных и экспериментальных эпимутаций, имеющих видимые фенотипические проявления и стабильно наследующихся в поколениях растений как менделевские признаки. Принципиальное отличие таких эпимутаций от классических мутаций – их обратимость. Эпигеном высших растений гораздо более пластичен по сравнению с их геномом. Частота возникновения точечных эпимутаций в сотни раз превышает частоту мутаций. Такая изменчивость, по-видимому, является главным источником фенотипической пластичности растений, позволяющей им адаптироваться к изменяющимся условиям окружающей среды в масштабах времени, слишком коротких для возникновения адаптивных мутаций. При быстрых изменениях жизненно важных условий наблюдается резкое повышение эпигенетического разнообразия в популяциях растений на практически неизменном генетическом фоне. Будучи достаточно пластичным для таких адаптивных изменений, эпигеном, с другой стороны, является достаточно стабильным для передачи этих адаптивных вариаций между поколениями растений. По-всей видимости, эпигенетические вариации, позволяющие растениям адаптироваться к быстро изменяющимся условиям среды, служат материалом для естественного отбора и других эволюционных процессов в соответствующих масштабах времени. Дополнительным обстоятельством, имеющим эволюционное значение, является способность эпигенетических механизмов индуцировать временные вспышки генетической изменчивости, например, за счет мобилизации транспозонов.

-------------------------------------------

Сокращения: DMP – дифференциально метилируемый сайт (от differentially methylated position; DMR – дифференциально метилируемый участок ДНК (от differentially methylated DNA region); N-DMPs – инвариантно метилированный сайт (от non-differentially methylated position); QTL – локус количественно варьирующего признака (от quantitative trait locus); RdDM – РНК-зависимое метилирование ДНК (от RNA-directed DNA methylation); siRNA – малая интерферирующая РНК (от small interfering RNA); SMP – точечный полиморфизм метилирования (от single methylation polymorphism).

Адрес для корреспонденции: Ашапкин Василий Васильевич. 119991 Москва, Воробьевы горы. Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского. Электронная почта: ashapkin@genebee.msu.ru; basilashapkin@gmail.com

Ключевые слова: Arabidopsis thaliana – метилирование ДНК – ДНК-метилом – эпигенетическая изменчивость – эпиаллель – эпимутация – адаптация – эволюция

 

ВВЕДЕНИЕ

Самой хорошо изученной и наиболее стабильной из всех эпигенетических модификаций является метилирование цитозиновых остатков ДНК [13]. ДНК растений метилируется обширным арсеналом специфических цитозиновых ДНК-метилтрансфераз, некоторые из которых не имеют аналогов у животных [2, 3]. Эти ферменты у растений, как и у животных, гомологичны бактериальным ДНК-метилтрансферазам и, очевидно, являются очень древним приобретением, приспособленным для собственных нужд многоклеточных организмов [4]. По предпочтению полуметилированных или неметилированных субстратов они делятся на два типа: de novo и поддерживающие. Уникальные гены в геноме растений метилированы главным образом, если не исключительно, по симметричным динуклеотидам CG, а транспозоны и повторяющиеся последовательности – по участкам трех типов: CG, CHG (где H соответствует любому нуклеотиду кроме G) и CHH.

За поддерживающее метилирование CG-типа во всех компартментах генома ответственна ДНК-метилтрансфераза MET1, являющаяся прямым аналогом и гомологом ДНК-метилтрансферазы Dnmt1, выполняющей аналогичную функцию у животных. Эта ДНК-метилтрансфераза осуществляет метилирование дочерних цепей ДНК непосредственно во время репликации. В этом ей помогают три родственных друг другу белка (VIM1–VIM3), содержащих домен SRA, узнающий полуметилированные CG-сайты в ДНК. Специфическая для растений ДНК-метилтрансфераза CMT3 содержит хромодомен, узнающий молекулы гистона H3, диметилированные по девятому остатку лизина (H3K9me2). Аналогично MET1 она осуществляет поддерживающее метилирование симметричных сайтов CHG, но механизм узнавания сайтов-мишеней в этом случае принципиально иной. В его основе лежит наличие обоюдных положительных связей между CMT3 и ферментами H3K9me2-метилирования, главным из которых является KRYPTONITE (KYP), также известный под унифицированным наименованием SUVH4. Показано, что CMT3 узнает и метилирует CHG-сайты в локусах хроматина, содержащих молекулы H3K9me2, а KYP, в свою очередь, метилирует молекулы гистона H3 в CHG-метилированных локусах [4]. Метилирование асимметричных сайтов CHH, очевидно, не может быть поддерживающим. Долгое время считалось, что за этот тип метилирования, как и за метилирование сайтов CG и CHG de novo, отвечает ДНК-метилтрансфераза DRM2, являющаяся прямым аналогом de novo метилтрансфераз Dnmt3 животных. Узнавание сайтов-мишеней, которые должны быть прометилированы, в этом случае осуществляется с помощью 24-нуклеотидных малых интерферирующих РНК (small interfering RNAs – siRNAs), комплементарных участкам соответствующих локусов, в сложном многостадийном процессе – РНК-зависимом метилировании ДНК (RNA-directed DNA methylation – RdDM). В действительности ситуация с CHH-метилированием у растений более сложная. Например, у арабидопсиса за метилирование CHH-сайтов отвечают две ДНК-метилтрансферазы, DRM2 и CMT2, причем каждая – за свою группу локусов [5, 6].

 

ЭПИАЛЛЕЛИ: ФЕНОТИПИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ,

НАСЛЕДУЕМОСТЬ, ИМПРИНТИНГ

Одним из наиболее наглядных и удивительных примеров спонтанных эпигенетических вариаций у растений может служить встречающаяся в естественных условиях у льнянки обыкновенной (Linaria vulgaris) мутация, изменяющая тип симметрии цветка с билатерального на радиальный. Эта мутация была впервые описана еще Карлом Линнеем около 250 лет назад, но лишь относительно недавно было установлено, что в действительности она является результатом эпигенетической модификации, т.е. не мутацией в классическом понимании, а эпимутацией [7]. Ген Lcyc, контролирующий морфологию цветка, у эпимутантов сильно метилирован и не активен. В последовательных поколениях растений это состояние стабильно передается по наследству вместе с мутантным фенотипом, а у редко возникающих ревертантов, имеющих нормальные цветки, ген Lcyc деметилирован и экспрессируется. Таким образом, эпимутация может стабильно наследоваться в течение очень многих поколений и тем самым играть существенную роль в эволюции.

Мутации гена SUPERMAN (SUP) влияют на развитие цветка у арабидопсиса. Известны наследуемые, но при этом довольно нестабильные мутации sup, так называемые аллели clark kent (clk), носители которых имеют фенотип, аналогичный фенотипу классических мутантов sup, но менее выраженный [8]. Нормальные цветки арабидопсиса содержат 6 тычинок и пестик из двух сросшихся плодолистиков. У делеционного мутанта sup-5 на первых десяти цветках образуется избыточное число тычинок (обычно 1213) и плодолистиков (обычно 3). У обладателей самого сильного аллеля clk в среднем по 8 тычинок и 34 плодолистика, а у более слабых – 67 тычинок и 3 плодолистика. Экспрессия гена SUP в растениях дикого типа происходит в клетках зачатка тычинок во время раннего развития цветочной меристемы. В растениях, гомозиготных по аллелю clk-3, в некоторых зонах цветочной меристемы она существенно снижена, а в других вообще не обнаруживается. Вопреки первоначальным ожиданиям секвенирование кодирующей области гена SUP в нескольких аллелях clk не обнаружило каких-либо изменений нуклеотидной последовательности. Более того, в клонированном виде аллель clk-3 приобретал способность к комплементации мутаций sup-5 у трансгенных растений, как если бы клонирование превращало его в аллель дикого типа. Очевидно, аллели clk представляют собой альтернативное эпигенетическое состояние гена SUP. Это предположение полностью подтвердилось при анализе метилирования методом бисульфитного секвенирования. Оказалось, что в растениях дикого типа ген SUP практически не содержит метилированных остатков цитозина, а у носителей аллелей clk он метилирован очень сильно. При этом сильный аллель clk-3 содержит 211 остатков 5-метилцитозина, а несколько более слабый clk-1 – на 6 остатков меньше. В одном из ревертантов аллеля clk-3 только 14 из исходных 211 остатков цитозина остались метилированными. Это коррелировало с восстановлением нормального уровня экспрессии.

Распределение метилированных остатков цитозина в аллеле clk-3 оказалось очень плотным и затрагивало все три типа сайтов (CG, CHG и CHH). В разных аллелях clk наборы метилированных остатков в основном совпадают. Так, в clk-1 и clk-3 204 метилированных остатка цитозина одинаковы, 7 – метилированы только в clk-3 и 1 – только в clk-1. Воспроизводимость наборов метилированных остатков в нескольких независимо возникших линиях растений clk свидетельствует о том, что в их основе лежит какой-то достаточно специфический механизм. Фенотип, напоминающий эффекты мутации sup, был обнаружен в некоторых линиях трансгенных растений арабидопсиса, содержащих антисмысловые конструкции MET1. Оказалось, что характер метилирования гена SUP в них примерно такой же, как в растениях линий clk. Из 186 остатков 5-метилцитозина, найденных у этих трансгенных растений, 183 совпадали с ранее обнаруженными в растениях clk-3. Примечательно, что в этих растениях выраженное гиперметилирование гена SUP наблюдается на фоне глобального 90% гипометилирования ДНК.

Эпимутант риса Epi-d1 был обнаружен более 90 лет назад как спонтанный карликовый мутант с метастабильным фенотипом [9]. С тех пор он поддерживается и используется как материал для генетических исследований в Университете Кюсю (Kyushu, Япония). Исследования причин его метастабильности показали, что он является мишенью эпигенетической регуляции, включающей довольно частые “переключения” между активным и репрессированным состояниями. Растения с эпимутацией Epi-d1 часто являются химерами, содержащими и карликовые, и нормальные побеги. Первые отличаются короткими темно-зелеными листьями, компактными метелками и маленькими круглыми зернами. К тому же разные растения Epi-d1 проявляют сильно варьирующие степени мутантного фенотипа от почти полностью карликового (Epi-dwarf) до почти нормального (Epi-normal).

На карликовых побегах обычно развиваются мелкие круглые зерна, а на нормальных побегах – нормальные зерна. Однако время от времени химерными оказывались и отдельные метелки. Это наводит на мысль, что переключения эпигенетических состояний часто происходят при переходе от вегетативной фазы развития к репродуктивной. В потомстве растений Epi-normal найдено в среднем 86.2% растений с нормальным фенотипом, 9.3% – с химерным и 4.5% – с карликовым, а в потомстве растений Epi-dwarf обнаружено 0.8% растений с нормальным, 26.6% – с химерным и 72.6% – с карликовым фенотипом. Следовательно, эпиаллель Epi-d1 в значительной степени наследуется между поколениями растений, но время от времени происходят переключения между эпигенетическими состояниями локуса в обоих направлениях. Epi-d1 оказался эпигенетически репрессированным состоянием гена DWARF1 (D1), кодирующего субъединицу GTP-связывающего белка. Причиной репрессированного состояния является метилирование повторяющейся последовательности в промоторной области гена. Уникальная характеристика этого эпиаллеля – метастабильность. С другой стороны, селекцией эпимутантов с наиболее выраженным мутантным фенотипом за несколько поколений удается получить растения с очень стабильным эпиаллелем. Еще одним ярким примером является эпимутация гена Colorless non-ripening (Cnr), нарушающая поспевание плода у томата [10]. Показано, что причиной нарушения является не мутация, а CG-гиперметилирование промоторной области. Как и в предыдущем примере, появление ревертантов – очень редкое событие, т.е. эпимутация чрезвычайно стабильна.

Существуют и примеры эпимутаций противоположной направленности, когда причиной мутантного фенотипа является не инактивация гена путем гиперметилирования, а наоборот, эктопическая активация гена в результате его деметилирования в тканях, где в нормальной ситуации он метилирован и не экспрессируется. Давно известным и хорошо изученным примером является ген FLOWERING WAGINENGEN (FWA). В вегетативных тканях растений дикого типа этот ген инактивирован благодаря метилированию промотора. Его эктопическая активация происходит при мутациях, подавляющих метилирование ДНК [1113], и фенотипически проявляется в виде запоздалого цветения. В данном случае эпимутация появляется не спонтанно, а в результате глобального деметилирования ДНК, обусловленного первичной мутацией (ddm1 или met1). Однако она может быть отделена от вызвавшей ее мутации путем аут-кроссинга (обратное скрещивание с растениями дикого типа, размножение дочерних растений самоопылением, селекция растений, не содержащих мутацию). В дочерних растениях, не содержащих мутацию, гипометилированное состояние гена FWA и ряда других генов сохраняется в течение многих последовательных поколений, но немало и таких локусов, в которых исходное метилирование постепенно восстанавливается.

С помощью деметилирующего агента 5-азадезоксицитидина была получена линия растений риса, в которой деметилированное состояние определенных локусов сохранялось в течение девяти поколений [14]. Один из таких локусов содержал ген Xa21G, стабильно репрессированный в растениях дикого типа, но конститутивно активный в деметилированной линии. Благодаря этому растения деметилированной линии оказались устойчивыми к патогену Xanthomonas oryzae, в то время как родительские растения весьма чувствительны к нему.

Чем именно определяет стабильность деметилированного состояния разных локусов, не вполне ясно. Известно, что склонность к довольно быстрому (в течение 35 поколений) восстановлению метилирования проявляют локусы, имеющие значительные количества комплементарных siRNAs [15]. Можно предположить, что устойчивость деметилированного состояния свойственна локусам, метилирование которых в норме зависит только от поддерживающей активности ДНК-метилтрансферазы MET1. Поскольку эта метилтрансфераза не обладает de novo активностью, такие последовательности долго остаются неметилированными. И наоборот, локусы, комплементарные siRNA, являются мишенями de novo метилирования системой RdDM и поэтому достаточно быстро восстанавливают свое метилирование. В промоторной области гена FWA присутствует тандемно повторенная последовательность, которая и является мишенью метилирования [16]. Вероятно, она обеспечивает надежную инактивацию гена в вегетативных тканях, а его нормальная экспрессия в центральной клетке женского гаметофита запускается путем активного деметилирования ДНК-гликозилазой DEMETER (DME) [17]. В этих случаях наличие определенной генетической информации in cis является причиной метилирования. Тем не менее, деметилированный эпиаллель fwa стабильно наследуется в поколениях самоопыляющихся растений, и его реметилирования не наблюдалось ни в одном из описанных экспериментов.

Удивительным примером реализации сложного биологического явления с помощью эпиаллелей может служить система самостерильности у растений сем. Крестоцветных [18]. У репы (Brassica rapa) она контролируется несколькими гаплотипами локуса S. Каждый гаплотип представлен двумя генами, мужским и женским, кодирующими белок S-локуса 11 (SP11) и его рецептор (SRK) соответственно. Специфическое для каждого гаплотипа взаимодействие между SP11 и SRK запускают процессы, приводящие к отторжению собственной пыльцы. Белки SP11 образуются в основном в диплоидных клетках тапетума и скапливаются на поверхности созревающей пыльцы. Фенотип самостерильности определяется отношениями доминантностирецессивности между двумя S-гаплотипами в клетках пыльника. У B. rapa имеется два класса гаплотипов: доминантные и рецессивные. Первые всегда доминантны по отношению ко вторым, а между собой – кодоминантны. Изучение экспрессии генов SP11 показало, что все они активно экспрессируются в гомозиготных растениях, но в гетерозиготных экспрессия рецессивных аллелей подавляется. Причиной инактивации рецессивного аллеля в каждом случае служит метилирование определенного участка его промоторной области по сайтам всех трех типов (CG, CNG и CHH), в то время как доминантный аллель остается неметилированным. В гомозиготных растениях такого метилирования не происходит. Метилируемые последовательности в промоторах разных рецессивных аллелей гомологичны друг другу. В промоторах доминантных аллелей они отсутствуют, но в вышележащей области найдена последовательность Smi (от SP11-methylation-inducer), служащая источником образования siRNA, гомологичной метилируемым последовательностям рецессивных аллелей. Синтез этой siRNA в гетерозиготных растениях индуцирует de novo метилирование промоторов рецессивных аллелей и, как следствие, их инактивацию. Поскольку в промоторах доминантных аллелей последовательность-мишень отсутствует, их метилирования и инактивации не происходит. Таким образом, наличие последовательности Smi перед доминантным аллелем в гетерозиготных растениях индуцирует in trans образование рецессивного эпиаллеля.

Наконец, особым примером образования эпиаллелей, регулирующих развитие и размножение растений, следует считать явление родительского импринтинга [19]. У большинства покрытосеменных растений эндосперм является триплоидной тканью, образующейся из слившихся центральной гомодиплоидной клетки и гаплоидной спермальной клетки. Вторая гаплоидная спермальная клетка оплодотворяет гаплоидную яйцеклетку, в результате чего образуется диплоидный зародыш. Аналогично плаценте млекопитающих, эндосперм выполняет чисто поддерживающую и питательную функцию в отношении зародыша и не участвует в формировании тканей следующего поколения. Именно эндосперм в первую очередь определяет успешность внутривидовых и межвидовых скрещиваний между родительскими растениями с различной плоидностью. При этом направления скрещивания обладают обратными эффектами: опыление материнских растений донорами пыльцы, имеющими более высокую плоидность, приводит к избыточному развитию эндосперма, а обратный вариант – к его супрессии. Последнее часто оказывается фатальным для развития семян. Одним из объяснений реципрокных эффектов является дерегуляция импринтированных генов. Геномная ДНК в эндосперме глобально недометилирована по сравнению с зародышем: почти все сайты CG, метилированные в зародыше, в эндосперме имеют уменьшенный уровень метилирования. В глобальном деметилировании материнского генома играет роль репрессия транскрипции гена MET1 и активность 5-метилцитозин-специфической ДНК-гликозилазы (DME) в центральной клетке и на ранних этапах развития эндосперма [20]. В результате деметилирования ДНК в центральной клетке активируются материнские аллели генов, которые в вегетативных тканях были репрессированы метилированием (например, MEDEA, FWA и FIS2).

Для нормального развития существенное значение имеет соотношение материнского и отцовского геномов в эндосперме. В норме эндосперм содержит два материнских и один отцовский геном, но у растений-апомиктов это соотношение часто нарушается. Предполагается, что развитие эндосперма у таких растений становится возможным благодаря компенсаторному изменению характера импринтинга родительских генов путем соответствующих изменений в их метилировании. У кукурузы обнаружено большое число специфических для эндосперма дифференциально метилируемых участков ДНК (differentially methylated DNA regions  DMRs) [21]. Они гипометилированы при передаче по женской линии, но нормально (так же, как в зародыше и листе) метилированы при передаче по мужской линии. Попытки опыления диплоидных растений Arabidopsis thaliana пыльцой тетраплоидных растений A. arenosa обычно безуспешны. Этот гибридизационный барьер можно преодолеть, повышая плоидность материнских растений. Однако гипометилирование материнской ДНК с помощью антисмысловых конструктов MET1 восстанавливает этот барьер, очевидно, смещая баланс активностей материнского и отцовского геномов в эндосперме. Это демонстрирует возможную роль метилирования ДНК в контроле межвидового обмена генами [22].

 

ЭПИГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ КАК МЕХАНИЗМ АДАПТАЦИИ

К ИЗМЕНЧИВЫМ УСЛОВИЯМ СРЕДЫ ОБИТАНИЯ

В одном из первых исследований роли эпигенетических перестроек в долговременной адаптации растений к изменившимся условиям внешней среды изучали метилирование различных участков генома факультативного галофитного растения Mesembryanthemum crystallinum к засолению почвы [23]. Уникальной особенностью этого растения является способность при водном дефиците и засолении переключаться с C3-пути фотосинтеза на CAM (Crassulacean Acid Metabolism) путь C4-фотосинтеза. Это переключение достигается за счет активации большой группы генов, среди которых “диагностическим” считается ген CAM-специфической формы PEP-карбоксилазы  ppc1. Уровень транскрипции этого гена резко возрастает при адаптации к солевому стрессу. Тем не менее, никаких изменений в характере метилирования его промоторной области обнаружить не удалось. Не изменялось и метилирование повторяющихся генов рРНК. Однако при солевом стрессе в 2 раза возрастало тотальное метилирование ДНК по сайтам CHG типа. Оказалось, что это возрастание связано главным образом, если не исключительно, с фракцией сателлитной ДНК. По-видимому, адаптация к солевому стрессу достигается за счет глобальной эпигенетической реорганизации хроматина, обеспечивающей переключение активности обширной группы генов.

В одной из первых попыток исследовать эпигенетические вариации, не зависящие от конкретных генетических локусов, использовали генетически однородную популяцию апомиктических растений одуванчика [24]. Идентичные по генотипу апомиктические клоны подвергали воздействию различных внешних факторов (солевой стресс, питательный стресс, индукция реакций защитного типа жасмоновой (JA) и салициловой (SA) кислотами), и изучали профили метилирования ДНК по сравнению с контрольными растениями. Во всех экспериментальных группах, включая контрольную, наблюдали вариации в метилировании ДНК. Вариации в растениях, подвергшихся стресс-факторам, были существенно выше (17.9%  JA, 29.6%  SA, 14.6%  солевой стресс, 13.2%  питательный стресс), чем в контрольных (7.6%). Бóльшая часть изменений в метилировании ДНК (74–92%) передавалась по наследству, однако в дочерних растениях нередко появлялись и новые изменения. Таким образом, один и тот же генотип в ситуациях внешнего стресса проявляет выраженную эпигенетическую пластичность. Важно отметить, что эпигенетические вариации наблюдаются не только между растениями разных экспериментальных групп, но и между индивидуальными растениями внутри каждой группы. Неясно, могут ли стресс-факторы приводить к направленным эпигенетическим изменениям, но они определенно повышают эпигенетическую изменчивость в целом.

Эпигенетические вариации как средство долговременной адаптации к условиям внешней среды в естественной ситуации исследовали на примере мангровых деревьев Laguncularia racemosa, растущих в двух соседствующих друг с другом экологических нишах: на берегу реки и солончаковом болоте [25]. По внешнему виду эти деревья явно различаются: деревья с побережья гораздо выше и толще. С помощью метода исследования полиморфизма амплифицированных рестрикционных фрагментов, чувствительных к метилированию ДНК, MSAP (от methyl-sensitive amplified polymorphism) исследовали характер метилирования репрезентативной популяции сайтов CCGG в этих растениях. Оказалось, что генетически растения обеих ниш близки друг другу, а эпигенетически отличаются очень сильно. В целом ДНК растений солончака метилирована заметно слабее, чем ДНК растений побережья. Следовательно, эпигенетические вариации служат важным фактором адаптации к особенностям среды обитания в естественных условиях.

На первый взгляд, кажется очевидным, что выживание генетически однородной популяции из небольшого числа особей при резком изменении условий среды обитания практически невозможно. Тем не менее, известны случаи успешных “вторжений” таких популяций в совершенно новую среду. Например, инвазивные популяции горца японского (Fallopia japonica) оккупировали большое число ниш в Европе и США [26]. Исследование генетического и эпигенетического разнообразия в растениях 16 популяций из трех экологических ниш (болото, побережье, обочины дорог) в районе Лонг Айленда показало, что эти растения очень близки генетически, но весьма разнообразны эпигенетически.

Конкретные эпигенетические механизмы в основе различных проявлений фенотипической пластичности, как правило, остаются невыясненными. Сравнение генетической вариабельности в популяциях арабидопсиса, живущих в разных климатических зонах, увенчалось неожиданной находкой, отчасти проливающей свет на эту проблему. Оказалось, что в регионах с сильными сезонными колебаниями температуры, значительно чаще встречаются растения с дефектами гена цитозиновой ДНК-метилтрансферазы CMT2 [27].

Судя по характеру этих дефектов (преждевременный стоп-кодон или мутация со сдвигом рамки считывания), функционально активная метилтрансфераза CMT2 в растениях отсутствует. И действительно, у некоторых из них характер CHH-метилирования транспозонов соответствует наблюдаемому в нуль-мутантах cmt2. С другой стороны, у большинства носителей этой мутации он почти не отличается от наблюдаемого в растениях дикого типа. Как бы то ни было, в лабораторных экспериментах показано, что нуль-мутанты cmt2 более устойчивы, чем изогенные растения дикого типа, к умеренному и сильному температурному стрессу. Из этих наблюдений следует два очевидных вывода. Во-первых, у многих носителей дефектного аллеля CMT2 недостаток активности метилтрансферазы CMT2 компенсируется какими-то другими ДНК-метилтрансферазами (скорее всего – DRM2 и/или CMT3). Во-вторых, отсутствие активности CMT2 увеличивает температурную пластичность растений, т.е. является адаптивным признаком.

Поскольку главная функция CMT2 – метилирование транспозонов [5], можно предположить, что увеличение температурной пластичности достигается за счет их мобилизации. Более обстоятельно этот вопрос изучен в недавнем исследовании на растениях из 150 популяций A. thaliana на территории Швеции [28]. ДНК-метилом в каждой популяции исследовали на растениях, выращенных при 10 или 16C,  температурах, при которых наблюдаются большие различия в динамике цветения. В ДНК-метиломах разных популяций обнаружено множество различий по всем трем типам метилируемых сайтов, а также по среднему на весь геном уровню метилирования. Температура не влияла на метилирование по сайтам CG и CHG, но заметно изменяла метилирование по сайтам CHH: при 16C средний уровень метилирования этих сайтов был на 14% выше, чем при 10C. С помощью полногеномного поиска ассоциаций (Genome-wide association studies  GWAS) было обнаружено, что степень CHH-метилирования генома в целом и, особенно транспозонов, зависит от двух полиморфных сайтов в локусе CMT2 (AT4G19020). Нереференсные варианты этих сайтов широко представлены в популяциях растений южных районов Швеции и существенно реже – северных.

Выращивание растений при 16C увеличивает степень CHH-метилирования для ~400 DMRs и уменьшает ее для ~200 DMRs по сравнению с выращиванием при 10C. Большинство этих чувствительных к температуре DMRs (“temperature DMRs”) перекрываются с последовательностями транспозонов или находятся в непосредственной близости от них. В особенности много таких DMRs в области сильно метилированных транспозонов, фланкированных слабо метилированными последовательностями генома. По сравнению с остальными, эти “вариабельные” транспозоны чаще локализованы в эухроматиновых участках хромосом, активнее экспрессируются и являются относительно более эволюционно молодыми. В отсутствие активности CMT2 (нуль-мутация cmt2) изменяется степень метилирования 33422 DMRs, а в отсутствие RdDM (нуль-мутация dcl3) – 10138 DMRs. DCL3-зависимые DMRs гораздо сильнее перекрываются с температурными DMRs (4703 из 10138, т.е. 46%), чем CMT2-зависимые (2299 из 33422, т.е. 7%). Следовательно, бóльшая часть температурных вариаций CHH-метилирования связана с активностью пути RdDM. В одной из популяций севера Швеции (TAA-03) CHH-метилирование по CMT2-зависимым DMRs практически отсутствует.

Оказалось, что в этой популяции часть гена CMT2 (от интрона 7 до экзона 16) делетирована, и на его месте имеется инсерция динуклеотидных повторов TC ≥ 330 п.н. Такая же делеция обнаружена еще в трех популяциях на севере Швеции (TAA-14, TAA-18 и Gro-3), что напоминает ситуацию с геном CMT1, поврежденным в большинстве рас арабидопсиса. Нуль-мутации гена CMT2 у арабидопсиса не имеют видимых фенотипических последствий. Это тем более удивительно, что этот ген эволюционно консервативен: он найден у всех исследованных в этом плане растений за исключением кукурузы [5]. Последнее отчасти объясняет низкую степень метилирования сайтов CHH в геноме кукурузы [29]. В геноме арабидопсиса метилирование сайтов CHH возникает в результате siRNA-зависимой активности метилтрансферазы DRM2 (RdDM-путь) и H3K9me2-зависимой активности метилтрансферазы CMT2. Каждая из них служит для инактивации определенной группы транспозонов, причем эти группы мало перекрываются и функционально различны.

В геноме кукурузы также обнаружено две группы транспозонов, различающихся по способу инактивации. Первые сильно метилированы по сайтам CHH и почти не содержат H3K9me2. Скорее всего, это метилирование осуществляется метилтрансферазой DRM по механизму RdDM. Вторая группа транспозонов практически не метилирована по сайтам CHH, но содержит большие количества H3K9me2. Существование дублирующих систем инактивации транспозонов ДНК-метилтрансферазой CMT2 и H3K9me2-метилтрансферазой KYP, объединенных взаимными прямыми положительными связями, очевидно, обеспечивает весьма стабильную инактивацию транспозонов. При утрате CMT2 транспозоны остаются инактивированными H3K9me2-метилированием, но надежность такой инактивации намного ниже, что должно проявляться в повышенной частоте мобилизации транспозонов. Последняя, в свою очередь, не может не приводить к дополнительному увеличению генетической и эпигенетической вариабельности.

Примером такой вариабельности может служить эпимутация clam (характерный фенотип в виде отсутствия элонгации стеблей и черешков), часто возникающая на фоне деметилирования генома в мутантах ddm1 [30]. Замечено, что исходно нестабильные эпимутации в последовательных поколениях самоопыляющихся растений стабилизируются и приобретают характерные черты моногенных менделевских признаков. Соответствующий локус (clm) генетически картирован в области, содержащей ген 22-α-гидроксилазы (DWF4). Это фермент синтеза брассиностероидов, регулирующих элонгацию. Секвенирование одного из стабильных мутантных аллелей обнаружило присутствие во втором экзоне 4-п.н. инсерции, приводящей к возникновению преждевременного стоп-кодона и, как следствие, синтезу укороченного белка. У растений с нестабильным clm-фенотипом в гене DWF4 обнаружена инсерция длинного (8479 п.н.) транспозона CAC1, содержащего концевые инвертированные повторы и ген транспозазы. В растениях самоопыляющихся линий ddm1 происходит мобилизация CAC1 и родственных ему элементов, поэтому их суммарная копийность повышена в несколько раз. Очевидно, реверсии к нормальному фенотипу у эпимутантов clm происходят при правильном вырезании траспозона, а стабилизация мутантного фенотипа – при вырезании с ошибкой (например, в виде остатка четырех нуклеотидов). У растений дикого типа транспозиций элементов этого семейства практически не наблюдается. Их мобилизация в ddm1 растениях, по-видимому, является прямым результатом деметилирования и транскрипционной активации находящегося в них гена транспозазы.

 

СИСТЕМАТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ЭПИГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ

В МАСШТАБАХ ЦЕЛОГО ГЕНОМА

Ситуация в области исследования эпигенетической изменчивости у растений кардинально изменилась, когда для исследования ДНК-метиломов стали использовать полногеномные подходы, основанные на сочетании процедуры бисульфитной модификации и высокопроизводительного параллельного секвенирования ДНК на платформах второго поколения [3]. Первые полные карты метилирования генома с разрешением до индивидуальных нуклеотидов (ДНК-метиломы) были получены для арабидопсиса [31, 32]. Эти выдающиеся исследования не только сгенерировали беспрецедентное количество информации о деталях метилирования генома у растений, но и по сути дела послужили исходной вехой для бурного развития области, которую мы сегодня знаем как эпигеномику. Анализ полученной в этих работах информации выходит за рамки данного обзора. Заинтересованного читателя мы отсылаем к своему предыдущему обзору [3], где такой анализ был представлен. Отметим лишь, что сам метод картирования метилированных остатков ДНК в масштабах целого генома и полученный в результате референсный ДНК-метилом A. thaliana расы Columbia послужили основой для множества исследований различных аспектов эпигенетики растений и животных, в том числе и в области, которую мы может обозначить как экологическая или эволюционная эпигенетика. Наряду с проектом “1001 геном арабидопсиса”, направленным на исследование естественного генетического разнообразия этого вида, создан и проект “1001 эпигеном арабидопсиса”, изучающий его эпигенетическое разнообразие.

Для оценки скорости спонтанных мутаций у арабидопсиса секвенировали геномы пяти растений так называемых “линий накопления мутаций” (mutation accumulation – MA lines), полученных за 30 генераций, c использованием одного семени в каждой, из референсной линии экотипа Col-0, для которой в 2000 г. была опубликована последовательность генома высокого качества [33]. Частота мутаций в виде однонуклеотидных замен оказалась равна ~7 × 10−9 на каждый нуклеотид генома на генерацию. Учитывая размер генома арабидопсиса (125 млн. п.н.), это соответствует примерно 1 точечной мутации на гаплоидный геном на генерацию. Частота коротких (13 п.н.) делеций – 0.40.8 × 10−9, инсерций – 0.20.4 × 10−9 на сайт на генерацию. Делеции длиннее 3 п.н. происходят с частотой 0.30.7 × 10−9 и при каждой из них теряется в среднем 800 п.н. последовательности. Таким образом, генетическая изменчивость генома арабидопсиса очень невелика. Это, на первый взгляд, противоречит его высокой приспособляемости к разнообразным условиям среды обитания. Логично предположить, что большую роль в адаптации к различным климатическим зонам наряду с генетической изменчивостью играет эпигенетическая.

На тех же самых линиях накопления мутаций были исследованы эпигенетические вариации, возникающие в потомстве одного растения за определенное число поколений. ДНК-метиломы растений из нескольких линий 30-го поколения сравнивали с ДНК-метиломами растений из трех линий 3-го поколения [34]. В общей сложности в ДНК-метиломах было найдено около 1.7 млн. метилированных сайтов CG, причем ~91% из них метилированы одинаково во все исследованных растениях. Остальные представляют собой вариабельно метилированные сайты CG (CG single methylation polymorphisms – SMPs). Сравнение метиломов растений 30- и 3-го поколений показало, что примерно 1.6% от всех CG-сайтов, имеющихся в геноме арабидопсиса, проявляют динамичность (приобретение или потерю) метилирования в последовательных поколениях. Частота возникновения эпимутаций (изменений статуса метилирования) составляла около 700 на генерацию, т.е. в сотни раз выше, чем частота классических мутаций. Следовательно, несмотря на относительную стабильность метилирования ДНК, эпимутации возникают гораздо чаще мутаций.

Дифференциально метилированные области (DMRs) представляют собой группы компактно расположенных метилируемых сайтов, статус метилирования которых изменяется достаточно синхронно (в каждом растении бóльшая часть сайтов внутри такой группы метилирована сходным образом). В общей сложности было обнаружено 2485 CG-DMRs длиной от 11 до 1110 п.н. Из них 60.5% локализовано в последовательностях генов или рядом с ними, 3.3% – в межгенных участках и 36.2% – в транспозонах. Количество CG-DMRs в экзонах примерно в два раза меньше, чем в интронах. В транспозонах эухроматиновых участков хромосом CG-DMRs довольно много, а в транспозонах околоцентромерных гетерохроматиновых участков – существенно меньше. Обнаружено также 284 non-CG-DMRs длиной от 10 до 682 п.н., содержащих дифференциально метилируемые сайты CHG и/или CHH. Большинство из них (141) расположены в межгенных участках, 57 – в последовательностях генов, 86 – в транспозонах. Обнаружено 72 DMRs, метилированных по сайтам всех трех типов (C-DMRs). Они, вероятно, являются мишенями siRNA-зависимого метилирования (RdDM). Примерно две трети из всех C-DMRs находятся в последовательностях транспозонов или межгенных участках генома, остальные – в генах или их промоторах.

Ни одна из ранее обнаруженных генетических вариаций не была ассоциирована с C-DMRs. Следовательно, они представляют собой спонтанные эпиаллели, не зависящие от генетических вариаций. Из 72 обнаруженных C-DMRs 46 имеют изменившийся, по сравнению с родительским, статус метилирования хотя бы в одной линии 30-го поколения, в том числе 29 – более чем в одной линии. Для семи C-DMRs наблюдались различия в метилировании между сестринскими растениями одной линии. Возможно, эти C-DMRs представляют собой “горячие точки” метилированиядеметилирования (метастабильные эпиаллели). Степень метилирования C-DMRs коррелирует с количеством комплементарных им молекул siRNA. Утрата метилирования в некоторых C-DMRs, ассоциированных с последовательностями генов, сопровождалась значительным увеличением концентрации транскриптов этих генов, а приобретение метилирования – с уменьшением. Следовательно, изменения статуса метилирования могут приводить к большим изменениям в транскрипции.

Сходные с вышеописанными результаты были получены в независимом и практически одновременном исследовании другой группы авторов [35]. И в этом случае было отмечено, что в целом по всему геному количество инвариантно метилированных сайтов CG (N-DMPs) в несколько раз больше, чем количество дифференциально метилируемых (DMPs). Такое же соотношение наблюдается в последовательностях транспозонов и межгенных участках, в то время как в последовательностях генов, наоборот, преобладают DMPs. Аналогичная, хотя и менее выраженная, диспропорция наблюдается и для метилирования сайтов CHG и CHH. Для инвариантно метилированных последовательностей характерно наличие большого числа участков, комплементарных 24-нуклеотидным siRNAs. По-видимому, наиболее стабильно метилирование участков генома, являющихся мишенями RdDM. В особенности это относится к последовательностям транспозонов и перицентромерным участкам хромосом.

В целом паттерны метилирования генома стабильны и наследуемы, а различия между ними накапливаются постепенно из поколения в поколение, аналогично накоплению мутаций. Одна линия (69-я) выделялась тем, что к 31-му поколению в ней накопилось на 40% больше эпимутаций, чем в остальных линиях. Глубокое секвенирование ее генома обнаружило несинонимическую мутацию в гене ДНК-метилтрансферазы MET3 (MEE57). Этот ген по данным генетического анализа играет важную роль в развитии эндосперма [36]. Развитие семян у инсерционных мутантов по гену MET3 останавливается вскоре после оплодотворения. Поскольку эпимутации возникают при смене поколений, можно предположить, что измененная активность MET3 может способствовать их возникновению. С другой стороны, обнаружена природная линия арабидопсиса (Dog-4), в которой ген MET3 содержит мутацию с образованием преждевременного стоп-кодона и, очевидно, является нулевым аллелем [37]. К сожалению, ни в одной из указанных работ не было представлено детального описания эпигенетических и фенотипических характеристик мутантов по гену MET3. Поэтому причинно-следственная связь между мутацией этого гена и повышенной частотой эпимутаций в линии 69 остается гипотетической.

Как мы уже отмечали, частота эпимутаций по индивидуальным цитозиновым остаткам в сотни раз превышает частоту классических мутаций. И действительно, по сравнению с референсными растениями 3-го поколения, в растениях каждой линии 31-го поколения накопилось не более 30 мутаций, тогда как число точечных эпигенетических отличий от эпигенома референсных растений примерно в тысячу раз выше. Следовательно, при всей стабильности метилирования ДНК точечные ошибки при наследовании эпигенома между поколениями встречаются довольно часто. Около 22% эпимутаций между 3- и 31-м поколениями растений возникли более одного раза, а 13%  более двух раз. Ожидаемая частота таких совпадений при случайном распределении эпимутаций относительно последовательности генома < 1%. Следовательно, определенные сайты имеют особо высокую вероятность увеличения или уменьшения степени метилирования. Анализ 32-го поколения растений в двух линиях обнаружил появление за одну генерацию около 3300 новых эпимутаций. Примерно в такой же степени различаются индивидуальные растения каждой линии в пределах одного поколения (~5000 DMPs). Это в 34 раза больше, чем можно было бы ожидать, исходя из 30 000 DMPs, накопленных между 3- и 31-м поколениями. Вероятно, лишь часть возникших при каждой генерации эпимутаций стабильно поддерживается в последующих поколениях. Все это вполне согласуется с представлениями о том, что частые изменения статуса метилирования происходят лишь в ограниченной группе сайтов, и эти изменения потенциально обратимы. Это косвенно подтверждается и тем, что более двух третей эпимутаций, возникших в растениях двух линий между 31- и 32-м поколениями, уже встречались в растениях других линий в 31-м поколении.

При анализе метилирования не по отдельным остаткам цитозина, а по группам компактно расположенных сайтов, найдено 249 дифференциально метилируемых областей (DMRs) длиной ≥ 50 п.н. (в среднем  100 п.н., максимум  650 п.н.). В растениях каждой линии их число сопоставимо с числом мутаций (менее 30). Как и CG-DMPs, они преимущественно локализуются в последовательностях генов и их промоторов. Никакой корреляции между локализацией эпимутаций и классических мутаций не наблюдается. Частота DMRs в генах примерно соответствует распределению метилированных цитозинов. В экзонах их на порядок больше, чем в интронах. При сравнении DMRs между 3- и 31-м поколениями более чем треть из них изменились более чем в одной линии. Очевидно, эти DMRs имеют повышенную вероятность изменений. Между 31- и 32-м поколениями происходит изменение статуса метилирования в среднем четырех DMRs, в том числе реметилирование одного, который был деметилирован к 31-му поколению. Таким образом, довольно большие изменения метилирования могут происходить даже за одну генерацию. Секвенирование транскриптомов двух линий 31-го поколения и линий 3-го поколения обнаружило 320 дифференциально экспрессируемых генов, в том числе семь перекрывающихся с DMRs. Для трех из последних, имеющих максимальные различия в уровнях экспрессии, наблюдалась обратная корреляция между метилированием и экспрессией. Следовательно, спонтанно возникающие эпимутации могут иметь явные фенотипические проявления. Некоторые DMRs подвергаются циклам деметилированияреметилирования в относительно коротких масштабах времени в последовательных поколениях растений. Это принципиально отличает эпимутации от мутаций.

По степени зависимости от генетических факторов эпимутации подразделяют на три типа: облигатные (obligate) – полностью зависящие от определенного генетического фактора; “облегченные” (facilitated) – возникающие в результате какой-то генетической вариации, например, инсерции транспозона по соседству, но не требующими обязательного наличия этой генетической вариации для своего стабильного поддержания; “чистые” (pure) – не зависящие от каких бы то ни было генетических вариаций [38]. Большинство известных эпиаллелей являются облигатными или облегченными, но существуют и чистые. Одним из механизмов возникновения чистых эпиаллелей может быть неполное поддержание метилированных состояний после оплодотворения, поскольку участки эпиаллельных вариаций перекрываются с локусами, метилирование которых изменяется в растениях с нуль-мутациями по гену поддерживающей ДНК-метилтрансферазы (met1) или генам ДНК-деметилаз (rdd) [32].

Оба родительских генома у арабидопсиса обслуживаются сложной системой эпигенетических механизмов для поддержания эпигенетической информации между поколениями. В этих механизмах присутствуют системы исправления ошибок, но их эффективность далека от 100%. Распределение вариаций метилирования в геноме очень неравномерно, например, их мало в транспозонах, экзонах генов и перицентромерных участках хромосом. Возможно, точность поддерживающего метилирования нуклеосомных участков ДНК выше, чем точность поддержания метилирования вненуклеосомных.

Возникновение эпигенетических вариаций вследствие мутаций было экспериментально продемонстрировано на мутантах ddm1, у которых уменьшалось метилирование ДНК в масштабах генома [11]. При этом реинтродукция нормального аллеля DDM1 не сразу восстанавливала нормальное метилирование, а постепенно. То же самое наблюдалось в мутантах met1 [13]. Многие из возникающих в этих мутантах эпигенетических вариаций приводили к стабильным, наследуемым в поколениях, фенотипическим эффектам даже в отсутствие вызвавшей их мутации. Еще одной причиной эпимутаций могут быть инсерции транспозонов. Например, в растениях A. thaliana линии Landsberg erecta (Ler) инсерция транспозона семейства Mutator в первый интрон гена FLOWERING LOCUS C (FLC) приводит к его siRNA-зависимому метилированию и ингибированию транскрипции [39].

Поскольку FLC является центральным репрессором цветения, слабая экспрессия приводит к независимым от вернализации быстрым сменам циклов цветения. В геноме арабидопсиса расы Columbia обнаружена группа из восьми ретротраспозонов ONSEN (Japanese ‘hot spring’), транскрипция которых активируется тепловым стрессом [40]. В отличие от других транспозонов, активируемых тепловым стрессом, транспозоны этой группы продолжают активно транскрибироваться в течение нескольких дней после возвращения к нормальной температуре. Мутации по генам биогенеза siRNAs стимулируют индукцию транскрипции транспозонов, но транспозиций в клетках вегетативных тканей при этом не наблюдается. Однако в потомстве растений, подвергнутых тепловому стрессу, обнаруживаются инсерции новых копий ONSEN в различные локусы. Судя по всему, активация транспозиций происходит во время развития цветков и перед гаметогенезом. Таких ретротранспозиций не обнаружено в потомстве растений дикого типа, подвергнутых тепловому шоку, а также в потомстве мутантов по биогенезу siRNAs, не подвергавшихся тепловому шоку. Следовательно, siRNA-зависимое метилирование ДНК (RdDM) играет важную роль в ограничении ретротранспозиций, индуцированных внешним стрессом.

Спонтанные и экспериментально индуцированные инсерции транспозонов ONSEN делают термочувствительными соседние гены. Следовательно, вспышки транспозиций при сбоях в системе siRNA-зависимого метилирования ДНК могут приводить к формированию новой регуляторной сети термочувствительных генов. Несмотря на сложную систему механизмов инактивации транспозонов у растений, их транспозиции могут происходить в пределах генерации и приводить к дополнительной эпигенетической изменчивости. Накопленные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что спонтанные мутации компонентов эпигенетических систем могут приводить к возникновению огромного числа наследуемых эпигенетических вариаций, служащих субстратом для естественного отбора.

Естественным примером облигатных эпиаллелей являются гены PAI2 и PAI3 семейства PAI у арабидопсиса [41]. В растениях расы Wassilewskija (WS) это семейство представлено четырьмя генами, из которых PAI2 является главным источником функционально активного фермента фосфорибозилантранилат-изомеразы (третий энзим в пути биосинтеза триптофана). У растений экотипа WS гены PAI2 и PAI3 локализованы в удаленных от других генов семейства локусах генома, а гены PAI1 и PAI4 образуют инвертированный повтор. В растениях дикого типа все четыре гена довольно сильно метилированы и экспрессируются слабо (в сумме – едва достаточно для обеспечения нормального фенотипа). При делеции пары PAI1-PAI4 происходит постепенное деметилирование двух оставшихся генов, сопряженное с активацией экспрессии гена PAI2 (ген PAI3 слабо экспрессируется даже в деметилированном состоянии), и восстановление нормального фенотипа. Очевидно, в растениях дикого типа инвертированный повтор PAI1-PAI4 не только индуцирует свое собственное метилирование за счет активности пути RdDM, но и метилирование генов PAI2 и PAI3. Следовательно, стабильное существование метилированных эпиаллелей PAI2 и PAI3 зависит от присутствия в геноме инвертированного повтора гомологичных генов PAI1 и PAI4.

Использование изогенных (полученных из одного растения) линий в лабораторных экспериментах позволяет анализировать эпигенетические варианты на фоне практически неизменного генома, т.е. отдельно от мутаций. В естественных условиях они коэволюционируют, обеспечивая фенотипическую изменчивость, на которую может действовать естественный отбор. Для выяснения типов и количества естественных вариантов метилирования ДНК секвенировали эпигеномы, траскриптомы и геномы диких популяций арабидопсиса из разных географических районов Северного полушария (152 ДНК-метилома, 144 транскриптома и 217 геномов) [42]. По сравнению с референсным ДНК-метиломом расы Col-0, в каждой из исследованных популяций было обнаружено ~400 тыс. точечных полиморфизмов метилирования (SMPs). В среднем на CG-, CHG- и CHH-SMPs приходится 23, 13 и 64% от всех SMPs соответственно. Статус метилирования SMPs в CG- и CHG-контекстах имеет тенденцию к метилированному состоянию в гетерохроматиновых перицентромерных участках хромосом и неметилированному – в богатых генами эухроматиновых плечах хромосом. В транспозонах CG- и CHG-SMPs чаще метилированы, а CHH-SMPs – не метилированы. В целом CHG- и CHH-SMPs сильнее метилированы в транспозонах, чем в уникальных генах, а CG-SMPs – наоборот. Дифференциально метилируемые области (DMRs) также распределены неодинаково: CG-метилированные (CG-DMRs) более характерны для кодирующих участков генов, а метилированные сразу по сайтам всех трех типов (C-DMRs) – для транспозонов. В генах C-DMRs чаще не метилированы, а в транспозонах  сильно метилированы. В общей сложности найдено 40 269 CG-DMRs средней длины в 321 п.н. и 13 485 C-DMRs средней длины в 221 п.н. Паттерны метилирования C-DMRs между географически удаленными популяциями различаются сильнее, чем паттерны метилирования CG-DMRs. Это можно объяснить их большей зависимостью от генетических факторов и/или очень высокой стабильностью. Разные органы одного растения (лист и соцветие) по паттернам метилирования CG-DMRs и C-DMRs различаются меньше, чем один и тот же орган в растениях разных географических популяций.

При сравнении транскриптомов наблюдается обратная ситуация. По-видимому, в процессах индивидуального развития метилирование ДНК не столь динамично, как транскрипция, и лишь отчасти контролирует тканеспецифическую экспрессию генов. Анализ генов, содержащих наибольшее число мутаций с выраженными фенотипическими эффектами, показал, что они относятся к тем же функциональным категориям, для которых характерно наибольшее количество C-DMRs (деградация белков, защитные реакции, регуляция развития). Следовательно, одни и те же гены наиболее подвержены генетическим и эпигенетическим изменениям. Для остальных генов корреляции между накоплением мутаций и эпимутаций не наблюдается. Близко расположенные друг к другу точечные полиморфизмы последовательности ДНК (SNPs) наследуются в высокой степени взаимозависимо вплоть до расстояний ~10 т.п.н. Близкая степень зависимости наблюдается и для C-DMRs. Это означает, что статус метилирования C-DMRs часто зависит от локальных генетических факторов. Для метилирования соседних CG-SMPs и CG-DMRs “расцепление” происходит гораздо раньше (в пределах 100 п.н.). Следовательно, они в основном не зависят от локальных генетических факторов. Из 92 C-DMRs-содержащих локусов в 16 были обнаружены структурные варианты. Сопоставление SNPs и C-DMRs в 152 популяциях обнаружило определенные C-DMRs, ассоциированные с локальными генетическими вариантами, например, эпиаллели генов семейства PAI.

Хорошо известно, что определенные генетические факторы важны для рекрутирования RdDM к локусам-мишеням. Например, это межгенные субтеломерные повторы ниже кодирующей последовательности гена MEDEA или повторы семейства SINE и тандемные повторы в области гена FWA. Эти элементы присутствуют и инвариантно метилированы во всех популяциях. Поиск локусов, которые имеют метилированные аллели (уровень метилирования ≥ 10%) в > 90% всех популяций выявил 283 гена и 255 транспозонов. Их экспрессия специфически активируется в пыльце. Возможно, эти гены и транспозоны являются специфическими мишенями RdDM, что позволяет инактивировать их в вегетативных тканях и обеспечивать активацию в тех герминальных клетках, где они необходимы. Другая возможная роль такой RdDM-зависимой регуляции – скоординировать экспрессию в пыльце и женском гаметофите.

У животных sRNA-зависимое метилирование ДНК используется для программирования эпигенома герминальных клеток с помощью Piwi-взаимодействующих РНК (piRNAs). На ранних этапах развития в клетках мужской герминальной линии происходит массовая дерепрессия транспозонов в результате глобального деметилирования ДНК [43]. Позднее паттерны метилирования восстанавливаются с помощью piRNA-зависимого метилирования ДНК. Отметим, что и у животных, и у растений эти малые РНК образуются в результате массовой дерепрессии транспозон-содержащих локусов в клетках-компаньонах, терминальных по своей природе, которые могут без последствий для потомства массово активировать транспозоны и повторяющиеся последовательности. Гены-мишени RdDM могли кооптировать механизм инактивации транспозонов для поддержания своего собственного инактивированного состояния в вегетативных тканях и при передаче между поколениями, обеспечивая при этом правильную экспрессию в пыльце, семени и развивающихся герминативных клетках.

Рассматривая вопрос о степени зависимости эпигенетических вариаций от генетических факторов, нельзя не упомянуть исследование, в котором использовали так называемые “эпигенетические рекомбинантные инбредные линии” (epigenetic recombinant inbred lines  epiRILs) [44]. Для получения этих линий, имеющих практически идентичные геномы, но множество вариаций в их метилировании, гомозиготное по рецессивной мутации ddm1-2 растение скрещивали с изогенным растением дикого типа. Мутация ddm1-2 приводила к утрате метилирования ДНК и дерепрессии множества транспозонов, что часто изменяет экспрессию соседствующих с ними генов, но лишь изредка приводит к их транспозициям. Как мы уже упоминали, некоторые изменения в метилировании ДНК и экспрессии генов, индуцированные мутацией ddm1-2, наследуются независимо от самой мутации. Одно из гетерозиготных (DDM1/ddm1-2) растений первого поколения скрещивали с родительским растением дикого типа и во втором поколении отбирали растения, гомозиготные по аллелю дикого типа (DDM1/DDM1). Каждое из них стало родоначальником отдельной линии (epiRILs, N > 500), полученной самоопылением в течение шести генераций.

Фенотипический анализ в этих линиях обнаружил высокую степень наследуемости, которая могла быть следствием стабильного наследования небольшого числа локусов, детерминирующих определенные количественно варьирующие характеристики (quantitative trait loci  QTLs) и возникших в каждом из родительских растений. Поскольку все растения имели один и тот же геном, было естественно предположить, что эти QTLs обусловлены стабильно наследуемыми вариантами метилирования ДНК. Исследование ДНК-метиломов 123 линий обнаружило сотни DMRs, наследующихся при половом размножении, как менделевские признаки. Эти DMRs использовали как маркеры для поиска эпигенетических QTLs (QTLepi), определяющих сложные признаки в популяции растений. Таким образом удалось картировать QTLepi для двух сложных характеристик с высокой степенью наследуемости: время цветения (flowering time  FT1) и длина первичного корня (primary root length  RL1). Анализ сцепления обнаружил высокозначимые для FT1 QTLepi на хромосомах 1, 4 и 5.

Растения, метилированные по этим трем QTLepi как родитель дикого типа, цветут существенно позже, чем растения, метилированные как мутантный родитель ddm1-2. В сумме эффекты этих трех QTLepi объясняют около 87% наследуемости данного признака. Эти QTLepi обнаружены в независимых исследованиях, одно из которых проводилось в оранжерее, а другое – в полевых условиях. Значит они устойчивы по отношению к изменяющимся условиям среды. Значимые для RL1 QTLepi найдены на хромосомах 1, 2 и 4. В этом случае эпигенотип дикого типа ассоциирован с более длинными первичными корнями по сравнению с эпигенотипом, унаследованным от родителя ddm1-2. В сумме эти три QTLepi объясняли около 60% наследуемости по данному признаку. В обоих случаях наследуемость в растениях epiRIL-линий обусловлена главным образом, если не исключительно, эпиаллелями, унаследованными от родительского растения, а не возникшими в ходе последующих генераций инбридинга.

В окрестностях QTLepi для FT найдено 325 DMRs (хромосома 1 – 53 DMRs; 4 – 16; 5 – 256), картированных к 44 уникальным генам, 153 транспозонам и 77 межгенным последовательностям. Для RL QTLepi найдено 506 DMRs (хромосома 1 – 122; 2 – 367; 4 – 17), картированных к 71 уникальным генам, 261 транспозонам и 122 межгенным последовательностям. Ни один из найденных генов не имел очевидной связи с регуляцией времени цветения и длины первичных корней. Как бы то ни было, индуцированные в растениях DMRs могут стабильно наследоваться и функционировать как локусы, контролирующие количественные признаки. Найденные QTLepi обладают всеми свойствами, необходимыми для того, чтобы служить мишенями естественного отбора. Сравнение ДНК-метиломов растений природных популяций [42] и epiRILs показало, что около 30% обнаруженных DMRs встречаются и в природных условиях. Очевидно, они могут представлять собой существенную часть так называемой “недостающей наследственности” (“missing heritability”).

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Неподвижные растения адаптируются к неблагоприятным и даже враждебным факторам внешней среды, часто проявляя поразительную фенотипическую пластичность. По своей природе эта пластичность – эпигенетическая, поскольку растение с одним и тем же генотипом в разных условиях может иметь разные фенотипы. При анализе причинно-следственных связей между конкретными проявлениями фенотипической пластичности и эпигенетической вариабельностью важно учитывать такие принципиальные свойства эпигенетических сигналов, как стабильность и способность наследоваться в поколениях. В отличие от генетических, изменения в метилировании ДНК могут происходить очень быстро и представляют собой средство адаптации к изменившимся условиям среды в интервалах времени, в которых возникновение адаптивных мутаций практически невозможно. Следовательно, они существенны для эволюции вида, даже если не передаются между поколениями. Однако наиболее обещающими с точки зрения долговременной адаптации, естественного отбора и эволюции, по-видимому, следует считать эпигенетические вариации, способные наследоваться в поколениях организмов независимо от конкретных генетических локусов. В этом случае эпигенетические вариации становятся материалом для естественного отбора и других эволюционных процессов [45]. При всей своей стабильности эпигенетические сигналы отличаются от классических мутаций своей потенциальной обратимостью и большей лабильностью. В эволюционных масштабах времени эпигенетически индуцированные адаптивные фенотипы, скорее всего, будут генетически ассимилированы. Тем не менее, даже учитывая их временную роль, эпигенетические механизмы остаются важнейшим средством первичной адаптации к быстро изменяющимся условиям среды.

Работа поддержана грантом Российского научного фонда № 14-50-00029.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

  1. Vanyushin B.F., Ashapkin V.V. DNA Methylation in Plants. New York: Nova Sci. Publ. Inc., 2009. 152 p.
  2. Law J.A., Jacobsen S.E. Establishing, maintaining and modifying DNA methylation patterns in plants and animals // Nat. Rev. Genet. 2010. V. 11. P. 204220. doi 10.1038/nrg2719
  3. Vanyushin B.F., Ashapkin V.V. DNA methylation in higher plants: past, present and future // Biochim. Biophys. Acta. 2011. V. 1809. P. 360368. doi 10.1016/j.bbagrm.2011.04.006
  4. Feng S., Jacobsen S.E. Epigenetic modifications in plants: an evolutionary perspective // Curr. Opin. Plant Biol. 2011. V. 14. P. 179186. doi 10.1016/j.pbi.2010.12.002
  5. Zemach A., Kim M.Y., Hsieh P.-H., Coleman-Derr D., Eshed-Williams L., Thao K., Harmer S.L., Zilberman D. The Arabidopsis nucleosome remodeler DDM1 allows DNA methyltransferases to access H1-containing heterochromatin // Cell. 2013. V. 153. P. 193–205. doi 10.1016/j.cell.2013.02.033
  6. Stroud H., Do T., Du J., Zhong X., Feng S., Johnson L., Patel D.J., Jacobsen S.E. Non-CG methylation patterns shape the epigenetic landscape in Arabidopsis // Nat. Struct. Mol. Biol. 2014. V. 21. P. 6472. doi 10.1038/nsmb.2735
  7. Cubas P., Vincent C., Coen E. An epigenetic mutation responsible for natural variation in floral symmetry // Nature. 1999. V. 401. P. 157–161. doi 10.1038/43657
  8. Jacobsen S.E., Meyerowitz E.M. Hypermethylated SUPERMAN epigenetic alleles in Arabidopsis // Science. 1997. V. 277. P. 11001103.
  9. Miura K., Agetsuma M., Kitano H., Yoshimura A., Matsuoka M., Jacobsen S.E., Ashikari M. A metastable DWARF1 epigenetic mutant affecting plant stature in rice // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009. V. 106. P. 11 21811 223. doi 10.1073/pnas.0901942106
  10. Manning K., Tör M., Poole M., Hong Y., Thompson A.J., King G.J., Giovannoni J.J., Seymour G.B. A naturally occurring epigenetic mutation in a gene encoding an SBP-box transcription factor inhibits tomato fruit ripening // Nat. Genet. 2006. V. 38. P. 948952. doi 10.1038/ng1841
  11. Kakutani T., Jeddeloh J.A., Richards E.J. Characterization of an Arabidopsis thaliana DNA hypomethylation mutant // Nucleic Acids Res. 1995. V. 23. P. 130137.
  12. Ronemus M.J., Galbiati M., Ticknor C., Chen J., Dellaporta S.L. Demethylation-induced developmental pleiotropy in Arabidopsis // Science. 1996. V. 273. P. 654657. doi 10.1126/science.273.5275.654
  13. Kankel M.W., Ramsey D.E., Stokes T.L., Flowers S.K., Haag J.R., Jeddeloh J.A., Riddle N.C., Verbsky M.L., Richards E.J. Arabidopsis MET1 cytosine methyltransferase mutants // Genetics. 2003. V. 163. P. 11091122.
  14. Akimoto K., Katakami H., Kim H.J., Ogawa E., Sano C.M., Wada Y., Sano H. Epigenetic inheritance in rice plants // Ann. Bot. 2007. V. 100. P. 205–217. doi 10.1093/aob/mcm110
  15. Teixeira F.K., Heredia F., Sarazin A., Roudier F., Boccara M., Ciaudo C., Cruaud C., Poulain J., Berdasco M., Fraga M.F., Voinnet O., Wincker P., Esteller M., Colot V. A role for RNAi in the selective correction of DNA methylation defects // Science. 2009. V. 323. P. 1600–1604. doi 10.1126/science.1165313
  16. Fujimoto R., Sasaki T., Kudoh H., Taylor J.M., Kakutani T., Dennis E.S. Epigenetic variation in the FWA gene within the genus Arabidopsis // Plant J. 2011. V. 66. P. 831–843. doi 10.1111/j.1365-313X.2011.04549.x
  17. Kinoshita T., Miura A., Choi Y., Kinoshita Y., Cao X., Jacobsen S.E., Fischer R.L., Kakutani T. One-way control of FWA imprinting in Arabidopsis endosperm by DNA methylation // Science. 2004. V. 303. P. 521523. doi 10.1126/science.1089835
  18. Shiba H., Takayama S. Epigenetic regulation of monoallelic gene expression // Dev. Growth Differ. 2012. V. 54. P. 120–128. doi 10.1111/j.1440-169X.2011.01317.x
  19. Köhler C., Kradolfer D. Epigenetic mechanisms in the endosperm and their consequences for the evolution of flowering plants // Biochim. Biophys. Acta. 2011. V. 1809. P. 438–443. doi 10.1016/j.bbagrm.2011.04.004
  20. Xiao W., Gehring M., Choi Y., Margossian L., Pu H., Harada J.J., Goldberg R.B., Pennell R.I., Fischer R.L. Imprinting of the MEA Polycomb gene is controlled by antagonism between MET1 methyltransferase and DME glycosylase // Dev. Cell. 2003. V. 5. P. 891901.
  21. Lauria M., Rupe M., Guo M., Kranz E., Pirona R., Viotti A., Lund G. Extensive maternal DNA hypomethylation in the endosperm of Zea mays // Plant Cell. 2004. V. 16. P. 510522.
  22. Bushell C., Spielman M., Scott R.J. The basis of natural and artificial postzygotic hybridization barriers in Arabidopsis species // Plant Cell. 2003. V. 15. P. 1430–1442.
  23. Дьяченко О.В., Захарченко Н.С., Шевчук Т.В., Бонерт Х., Кушман Дж., Бурьянов Я.И. Гиперметилирование CCWGG-последовательностей в ДНК растений Mesembryanthemum crystallinum при их адаптации к солевому стрессу // Биохимия. 2006. Т. 71. С. 570575.
  24. Verhoeven K.J.F., Jansen J.J., van Dijk P.J., Biere A. Stress-induced DNA methylation changes and their heritability in asexual dandelions // New Phytol. 2010. V. 185. P. 1108–1118. doi 10.1111/j.1469-8137.2009.03121.x
  25. Lira-Medeiros C.F., Parisod C., Fernandes R.A., Mata C.S., Cardoso M.A., Ferreira P.C.G. Epigenetic variation in mangrove plants occurring in contrasting natural environment // PLoS One. 2010. V. 5: e10326. doi 10.1371/journal.pone.0010326
  26. Richards C.L., Schrey A.W., Pigliucci M. Invasion of diverse habitats by few Japanese knotweed genotypes is correlated with epigenetic differentiation // Ecol. Lett. 2012. V. 15. P. 10161025. doi 10.1111/j.1461-0248.2012.01824.x
  27. Shen X., de Jonge J., Forsberg S.K.G., Pettersson M.E., Sheng Z., Hennig L., Carlborg O. Natural CMT2 variation is associated with genome-wide methylation changes and temperature seasonality // PLoS Genet. 2014. V. 10: e1004842. doi 10.1371/journal.pgen.1004842
  28. Dubin M.J., Zhang P., Meng D., Remigereau M.-S., Osborne E.J., Casale F.P., Drewe P., Kahles A., Jean G., Vilhjalmsson B., Jagoda J., Irez S., Voronin V., Song Q., Long Q., et al. DNA methylation in Arabidopsis has a genetic basis and shows evidence of local adaptation // eLife. 2015. V. 4: e05255. doi 10.7554/eLife.05255
  29. West P.T., Li Q., Ji L., Eichten S.R., Song J., Vaughn M.W., Schmitz R.J., Springer N.M. Genomic distribution of H3K9me2 and DNA methylation in a maize genome // PLoS ONE. 2014. V. 9: e105267. doi 10.1371/journal.pone.0105267
  30. Miura A., Yonebayashi S., Watanabe K., Toyama T., Shimada H., Kakutani T. Mobilization of transposons by a mutation abolishing full DNA methylation in Arabidopsis // Nature. 2001. V. 411. P. 212214.
  31. Cokus S.J., Feng S., Zhang X., Chen Z., Merriman B., Haudenschild C.D., Pradhan S., Nelson S.F., Pellegrini M., Jacobsen S.E. Shotgun bisulphite sequencing of the Arabidopsis genome reveals DNA methylation patterning // Nature. 2008. V. 452. P. 215219. doi 10.1038/nature06745
  32. Lister R., O’Malley R.C., Tonti-Filippini J., Gregory B.D., Berry C.C., Millar A.H., Ecker J.R. Highly integrated single-base resolution maps of the epigenome in Arabidopsis // Cell. 2008. V. 133. P. 523536. doi 10.1016/j.cell.2008.03.029
  33. Ossowski S., Schneeberger K., Lucas-Lledo J.I., Warthmann N., Clark R.M., Shaw R.G., Weigel D., Lynch M. The rate and molecular spectrum of spontaneous mutations in Arabidopsis thaliana // Science. 2010. V. 327. P. 9294. doi 10.1126/science.1180677
  34. Schmitz R.J., Schultz M.D., Lewsey M.G., O’Malley R.C., Urich M.A., Libiger O., Schork N.J., Ecker J.R. Transgenerational epigenetic instability is a source of novel methylation variants // Science. 2011. V. 334. P. 369373. doi 10.1126/science.1212959
  35. Becker C., Hagmann J., Muller J., Koenig D., Stegle O., Borgwardt K., Weigel D. Spontaneous epigenetic variation in the Arabidopsis thaliana methylome // Nature. 2011. V. 480. P. 245249. doi 10.1038/nature10555
  36. Pagnussat G.C., Yu H.J., Ngo Q.A., Rajani S., Mayalagu S., Johnson C.S., Capron A., Xie L.F., Ye D., Sundaresan V. Genetic and molecular identification of genes required for female gametophyte development and function in Arabidopsis // Development. 2005. V. 132. P. 603614. doi 10.1242/dev.01595
  37. Cao J., Schneeberger K., Ossowski S., Günther T., Bender S., Fitz J., Koenig D., Lanz C., Stegle O., Lippert C., Wang X., Ott F., Müller J., Alonso-Blanco C., Borgwardt K., et al. Whole-genome sequencing of multiple Arabidopsis thaliana populations // Nat. Genet. 2011. V. 43. P. 956963. doi 10.1038/ng.911
  38. Schmitz R.J., Ecker J.R. Epigenetic and epigenomic variation in Arabidopsis thaliana // Trends Plant Sci. 2012. V. 17. P. 149154. doi 10.1016/j.tplants.2012.01.001
  39. Liu J., He Y., Amasino R., Chen X. siRNAs targeting an intronic transposon in the regulation of natural flowering behavior in Arabidopsis // Genes Dev. 2004. V. 18. P. 2873–2878. doi 10.1101/gad.1217304
  40. Ito H., Gaubert H., Bucher E., Mirouze M., Vaillant I., Paszkowski J. An siRNA pathway prevents transgenerational retrotransposition in plants subjected to stress // Nature. 2011. V. 472. P. 115–119. doi 10.1038/nature09861
  41. Bender J., Fink G.R. Epigenetic control of an endogenous gene family is revealed by a novel blue fluorescent mutant of Arabidopsis // Cell. 1995. V. 83. P. 725734.
  42. Schmitz R.J., Schultz M.D., Urich M., Nery J.R., Pelizzola M., Libiger O., Alix A., McCosh R.B., Chen H., Schork N.J., Ecker J.R. Patterns of population epigenomic diversity // Nature. 2013. V. 495. P. 193198. doi 10.1038/nature11968
  43. Aravin A.A., Sachidanandam R., Bourchis D., Schaefer C., Pezic D., Toth K.F., Bestor T., Hannon G.J. A piRNA pathway primed by individual transposons is linked to de novo DNA methylation in mice // Mol. Cell. 2008. V. 31. P. 785799. doi 10.1016/j.molcel.2008.09.003
  44. Cortijo S., Wardenaar R., Colomé-Tatché M., Gilly A., Etcheverry M., Labadie K., Caillieux E., Hospital F., Aury J.-M., Wincker P., Roudier F., Jansen R.C., Colot V., Johannes F. Mapping the epigenetic basis of complex traits // Science. 2014. V. 343. P. 11451148. doi 10.1126/science.1248127
  45. Eichten S.R., Schmitz R.J., Springer N.M. Epigenetics: beyond chromatin modifications and complex genetic regulation // Plant Physiol. 2014. V. 165. P. 933947. doi 10.1104/pp.113.234211