УДК 581.1:575.2

СИСТЕМА CRISPR/CAS9 ДЛЯ РЕДАКТИРОВАНИЯ ГЕНОМОВ И ОСОБЕННОСТИ ЕЕ ПРИМЕНЕНИЯ НА ОДНОДОЛЬНЫХ РАСТЕНИЯХ

©2017 г. С. В. Герасимоваa, b,1, Е. К. Хлесткинаa, b, А. В. Кочетовa, b, В. К. Шумныйa, b

aФедеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирск

bФедеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования “Новосибирский национальный исследовательский государственный университет”, Новосибирск

Поступила в редакцию 13.04.2016 г.

В последние годы активно развивается новый комплекс методов модификации ДНК – геномное редактирование. Настоящий обзор на примере однодольных растений сравнивает предлагаемые разными группами исследователей способы оптимизации и расширения возможностей новейшей системы геномного редактирования CRISPR/Cas9. Рассматриваются методические подходы к подбору сайтов-мишеней in silico, дизайну экспрессионного вектора, переносу экспрессионной кассеты вектора в клетки растений, оценке результатов редактирования и неспецифической активности системы, получению модифицированных растений, свободных от чужеродной ДНК. Обсуждается проблема законодательного регулирования и перспектива использования данного метода в хозяйственных целях.

----------------------------------

Сокращения: нРНКнаправляющая РНК; CRE – cis-regulatory element; CRISPR – clustered regulatory interspaced short palindromic repeats; PAM – protospacer adjacent motif; TALEN – transcription activator-like effector nucleases; TILLING – targeting induced local lesions in genomes; ZFN – zinc-finger nuclease.

1Адрес для корреспонденции: Герасимова Софья Викторовна. 630090, Новосибирск, Россия, пр. ак. Лаврентьева, 10. Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук (ИЦиГ СО РАН). Электронная почта: gerson@bionet.nsc.ru

Ключевые слова: геномная инженерияредактирование генома – CRISPR/Cas9зерновые культуры – злаки – нокаут гена – трансгенные растения – ГМО

 

ВВЕДЕНИЕ

Многовековой процесс культивирования растений и отбора лучших вариантов привел к богатому разнообразию культурных форм и широкому ареалу их возделывания [1]. В ХХ веке произошел скачок в технологии улучшения свойств существующих форм растений благодаря широкому внедрению методов комбинационной селекции, а также применению радиационного и химического мутагенеза для увеличения генетического разнообразия [2]. С 1990-х гг. в дополнение к методам классической селекции стали использоваться методы ДНК-маркирования позволяющие ускорять создание новых улучшенных сортов [3, 4].

Несмотря на явный прогресс в методологических подходах селекции, создание новых генотипов происходит главным образом на основе комбинирования существующих в природе вариантов генов того же самого или близких видов растений [5]. Эти варианты генов и их комбинации часто недостаточны для создания генотипов, отвечающих всем современным требованиям, предъявляемым к сортам. В связи с этим пристальное внимание уделяется новым прорывным технологиям в области биологии, и рассмотрению возможности их использования для качественного улучшения селекционного процесса. В конце ХХ века, с развитием рекомбинантных технологий и методик генетической трансформации растений стало возможным создание организмов с заданными свойствами при помощи манипуляций с последовательностями ДНК [6]. В последние годы активно развивается новый комплекс методов модификации ДНК, получивший название «редактирование генома» или «геномная инженерия». Эти методы на сегодняшний день являются наиболее тонкой и специфической техникой модификации функций живых клеток и естественной структуры генома. Методы геномной инженерии используют широкий молекулярный инструментарий, а результат их воздействия оказывает минимально возможные побочные эффекты [6, 7].

Инженерия геномов растений имеет огромный потенциал, как способ получения желаемых комбинаций признаков в значительно меньшие сроки, чем с применением методов классической селекции [8]. Создание новых улучшенных форм с использованием методов геномной инженерии для направленной модификации генов несет в себе меньше побочных эффектов и рисков, чем применение случайного ненаправленного мутагенеза (химического и радиационного) или методов традиционной генетической инженерии, поскольку в случае геномного редактирования вмешательство происходит в строго определенные локусы генома и позволяет минимизировать или даже полностью избежать случайных мутаций или случайных встроек чужеродной ДНК [6].

В области геномной инженерии растений наименее охваченными остаются зерновые злаки со сложными геномами и с трудом поддающиеся трансформации [9], такие как пшеница и ячмень. Вместе с тем зерновые злаки являются важнейшими источниками растительного белка и углеводов, витаминов группы В и минеральных солей, а также служат важным источником кормового сырья, биоэтанола и целлюлозы [10, 11].

В данной статье представлен обзор работ по редактированию геномов злаковых растений с использованием системы CRISPR/Cas. Первые сообщения об успешных изменениях в геномной ДНК растений при помощи системы CRISPR/Cas9 относятся к 2013 году, поэтому устоявшихся и многократно проверенных методик геномного редактирования до сих пор еще нет, особенно для имеющих сложные геномы злаковых растений разные группы исследователей предлагают разные способы оптимизации и расширения возможностей системы CRISPR/Cas9 [7, 8].

 

СПЕЦИФИЧЕСКИЕ НУКЛЕАЗЫ – ОСНОВНОЙ ИНСТРУМЕНТ РЕДАКТИРОВАНИЯ ГЕНОМОВ

Суть редактирования геномов заключается в направленном сайт-специфическом образовании двухцепочечных разрывов ДНК, которые впоследствии ликвидируются системами репарации клетки [7, 12]. Существует два способа репарации двухцепочечных разрывов [13]: негомологичное сшивание концов и гомологичная рекомбинация (рис. 1). Оба способа могут быть использованы для искусственных модификаций последовательности геномной ДНК. При первом способе репарации происходит соединение концов разорванной цепочки ДНК лигазой IV. При этом с высокой вероятностью в точке разрыва возникают мутации: замены нуклеотидов, небольшие инсерции или делеции. Если разрыв произошел в кодирующей части гена, велика вероятность сдвига рамки считывания и нокаута гена. В случае двух и более разрывов существует вероятность потери участка ДНК и образования протяженной делеции. Таким образом, индукция двухцепочечных разрывов и их репарация путем негомологичного сшивания концов могут использоваться для нокаута генов или получения специфических делеций [8, 14]. При наличии донорной ДНК негомологичное сшивание концов может сопровождаться инсерцией заданного фрагмента [15].

Второй способ репарации разрыва – это гомологичная рекомбинация (рис. 1). Если присутствует фрагмент ДНК, имеющий гомологию с участками, прилегающими к разрыву, он используется как матрица для репарации. Этот путь репарации позволяет осуществлять направленные замены участков генов (вплоть до коррекции отдельных нуклеотидов) и сайт-специфическую встройку фрагмента ДНК, например, целевого гена [8, 14].

Существует несколько различных молекулярных систем, индуцирующих сайт-специфические разрывы ДНК [16]. В течение последнего десятилетия делались попытки применения разных систем редактирования геномов у хозяйственно значимых растений [7, 17, 18]. В таблице 1 представлен краткий обзор работ, проведенных на зерновых злаках с использованием таких систем редактирования геномов, как мегануклеазы, нуклеазы ZFN (Zinc-finger nucleases – химерный белок, содержащий ДНК-узнающий домен типа “цинковые пальцы” и функциональный домен эндонуклеазы FokI) и TALEN (transcription activator-like effector nucleases эффекторные нуклеазы, подобные активаторам транскрипции). При помощи этих систем удалось получить однодольные культурные растения, обладающие целевыми признаками: устойчивостью к патогенам [19, 20], снижением содержания нежелательных веществ в зерне [21], мужской стерильностью [22].

Прорывом в технологии направленной сайт-специфической модификации геномов стало появление системы, названной CRISPR/Cas9 (CRISPR, clustered regulatory interspaced short palindromic repeats - короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами; Cas, CRISPR associated – эндонуклеаза, ассоциированная с CRISPR). Эта система состоит из двух компонент (рис. 2а): мономерной нуклеазы Cas9 Streptococcus pyogenes и химерной направляющей РНК (guide RNA), обозначаемой как нРНК (gRNA). Направляющая РНК имеет двадцатинуклеотидный участок гомологии с последовательностью-мишенью в геномной ДНК. Нуклеаза Cas9 вносит разрывы в определенные участки ДНК, специфически связывающиеся с направляющей РНК. Система CRISPR/Cas9 имеет ряд преимуществ перед остальными способами геномного редактирования (подробно изложено в обзорах [15, 32]) и является наиболее популярным способом направленного мутагенеза, область применения которого очень быстро расширяется. Разнообразные модификации элементов системы CRISPR/Cas9 открывают дополнительные возможности специфической коррекции работы молекулярных систем клетки [33, 34] и перспективы ускорения многих исследований, посвященных функционированию генома [35].

Процесс получения модифицированных растений или растительных клеток методом геномного редактирования состоит из следующих этапов (рис. 3):

1) подбор последовательностей-мишеней и дизайн направляющих РНК;

2) конструирование генетических векторов, несущих нуклеазу Cas9, нРНК и, если необходимо, дополнительные элементы;

3) введение “инструментов редактирования” в клетки растений;

4) детекция изменений в геномной ДНК;

5) избавление от чужеродной ДНК [32, 36].

 

КОНСТРУИРОВАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ВЕКТОРОВ

Выбор последовательности-мишени и дизайн нРНК

Для того чтобы эффективно нацелить нуклеазу Cas9 на определенный сайт генома, необходимо сконструировать гибридную направляющую РНК (нРНК), которая состоит из универсальной невариабельной части (каркаса, gRNA scaffold) и вариабельной части, представляющей собой участок гомологии с конкретной последовательностью-мишенью в геномной ДНК (рис. 2). Вариабельную часть нРНК называют спейсером. Его оптимальная длина составляет 20 нуклеотидов. Последовательность-мишень в геномной ДНК должна отвечать следующим двум условиям [32]:

1) к 5’-концу данной последовательности непосредственно должна примыкать короткая нуклеотидная последовательность, называемая PAM (Protospacer adjacent motif – мотив, примыкающий к протоспейсеру). При использовании Cas9 Streptococcus pyogenes мотив PAM должен иметь вид NGG, где N – произвольный нуклеотид;

2) в редактируемом геноме данная последовательность должна быть уникальной.

Выбор последовательности-мишени в геномной ДНК определяет структуру нРНК (рис. 2б), от которой зависит специфичность и эффективность системы CRISPR/Cas [37].

Двухцепочечный разрыв, как правило, происходит ближе к 3’-концу последовательности-мишени, за три нуклеотида до PAM. Чтобы индуцировать образование двухцепочечного разрыва, необходимо обеспечить точное связывание 8-12 нуклеотидов сайта-мишени, прилегающих к PAM, с нРНК. Эта часть называется якорной последовательностью (“seedsequence). В 5’-районе сайта-мишени допустимы отдельные несоответствия нуклеотидов и нарушения спаривания. Если в геноме существуют последовательности, имеющие гомологию с выбранным сайтом-мишенью, особенно с его 3’-районом, существует вероятность образования дополнительных разрывов ДНК [32]. Если последовательность спейсера будет иметь гомологию с другими частями нРНК, или формировать вторичную структуру, это может исказить структуру нРНК и негативно повлиять на эффективность мутагенеза [37].

Вероятность неспецифической активности Cas9 и искажений структуры нРНК необходимо учитывать и минимизировать при дизайне эксперимента. Для подбора оптимальных последовательностей-мишеней разработано программное обеспечение, доступное в сети Internet в режиме online. Специальные программы позволяют находить в выбранной последовательности нуклеотидов (например, в конкретном гене) сайты-мишени для системы CRISRP/Cas, а также предсказывать неспецифические сайты, имеющие гомологию с последовательностью-мишенью. В таблице 2 представлены веб-ресурсы, разработанные, в частности, для дизайна эксперимента по редактированию геномов однодольных культурных растений. На основании ряда экспериментов по успешному редактированию геномов растений, были сформулированы критерии, которым отвечает оптимальная по структуре нРНК:

1) GC-состав в пределах 3080%;

2) интактная вторичная структура, нарушения допустимы только в первой петле нРНК (stem-loop 1);

3) не более, чем 12 связей всего, и не более 7 связей подряд, между нуклеотидами последовательности спейсера и остальной части нРНК;

4) не более 6 связей между нуклеотидами внутри спейсера.

Было показано, что нРНК, отвечающие этим критериям, имеют высокую эффективность при редактировании генома риса [37]. Кроме того, в отдельных работах было показано, что мишени с более высоким GC-составом редактируются с большей эффективностью [44, 45].

С помощью программы CRISPR-PLANT была проведена оценка общего количества высокоспецифичных сайтов-мишеней для CRISPR/Cas [39] в геномах различных растений. Было показано, что у однодольных растений, в отличие от двудольных, количество специфических сайтов-мишеней не коррелирует с размером генома. Было проанализировано 4 вида однодольных растений (Brachypodium distachyon, Oryza sativa, Sorghum bicolor, Zea mays), и показано, что несмотря на различия в размерах геномов, все 4 вида обладают схожим количеством специфических сайтов-мишеней. Подсчет относительного количества аннотированных генов, для которых возможен дизайн специфичных нРНК, показал, что для риса и сорго возможно специфически нацелить систему CRISPR/Cas9 приблизительно на 90% генов, а для кукурузы только на 30% генов. Количество возможных сайтов для геномного редактирования определяется числом мотивов PAM в геноме и содержанием повторенных и высокогомологичных последовательностей. В работе Hu с соавт. предложен подход к увеличению количества сайтов и генов, доступных для редактирования, путем использования вариантов Cas9, распознающих альтернативные варианты PAM [46]. В случае гомологии сайта-мишени с другими районами генома высока вероятность неспецифической активности системы и индукции нежелательных мутаций в нецелевых (off-target) сайтах. Предполагается, что для зерновых злаков с большими геномами и высоким содержанием повторенных последовательностей (таких как кукуруза, ячмень и пшеница) для определенных генов может быть сложно подобрать высокоспецифичные нРНК, которые оказывали бы минимальные побочные эффекты. Однако в этом случае можно применить специальные модификации методики CRISPR/Cas, которые в значительной степени повышают ее специфичность [47]. Методы детекции неспецифических мутаций при геномном редактировании и способы повышения специфичности системы CRISPR/Cas обуждаются ниже в разделе “Оценка неспецифической активности системы CRISPR/Cas”.

Конструирование экспрессионных кассет для CAS9 и нРНК

Структура экспрессионной кассеты для геномного редактирования зависит от цели исследования и метода трансформации. Если исследование ограничивается тестированием метода на популяции клеток, например, протопластов, возможно использовать два простых вектора, один из которых несет Cas9, другой – направляющую РНК [48]. Для трансформации клеток с целью получения трансгенных растений используют, как правило, векторы, содержащие Т-ДНК-область, которая переносится в геном растений при агробактериальной трансформации. В пределах Т-области располагаются обычно минимум три гена с необходимыми регуляторными элементами, обеспечивающими их экспрессию: ген нРНК, ген Cas9 и ген селективного маркера, позволяющего произвести отбор трансформантов.

Для экспрессии специфических направляющих РНК конструируются кассеты, состоящие из промотора, каркаса нРНК, и терминатора. Последовательность спейсера вводится в вектор для экспрессии нРНК при помощи рестрикции и лигирования вектора с двухцепочечным олигонуклеотидом с липкими концами или при помощи специфической ПЦР [44, 48, 49]. Размер одной кассеты для экспрессии нРНК составляет порядка 400-500 нуклеотидов. Для направляющих РНК используют промоторы РНК-полимеразы III, преимущественно промоторы малых ядерных РНК U3 и U6. Для однодольных растений успешно используются промоторы U3 и U6 риса, пшеницы и кукурузы [15]. Стартом инициации транскрипции с промотора U3 является А, а с промотора U6 – G, что следует учитывать при выборе последовательности-мишени. Для промотора U3 мишень должна иметь структуру 5’-AN(19)NGG (где NGG – это PAM), для U6 – 5’-GN(19)NGG. Если мишень начинается с С или Т, на 5’-конце спейсера нужно добавлять еще один соответствующий нуклеотид [44]. Сравнение эффективности геномного редактирования у риса при использовании разных промоторов для нРНК в одних случаях не показало существенных различий [44], в других выявило повышенную эффективность при использовании промотора U6 [50].

Кассеты для экспрессии Cas9, как правило, состоят из промотора, адаптированной по кодоновому составу кодирующей последовательности Cas9, сигнала ядерной локализации и терминатора [51]. Оптимизированная по кодоновому составу в соответствии с частотой использования кодонов в генах человека Cas9 успешно применялась для редактирования геномов ряда растений, в том числе ячменя [52]. В то же время было показано, что оптимизированная по кодоновому составу генов растений (как однодольных, так и двудольных) Cas9 более эффективна для однодольных растений, чем оптимизированная по кодоновому составу генов человека [49, 50]. Многие гены растений семейства Gramineae характеризуются повышенным GC-составом 5‘-области кодирующей части. В работе Ma с соавт. был получен вариант Cas9, по GC-составу соответствующий строению генов злаков: первые 400 нуклеотидов имели повышенный GC-состав (62.5%), при общем GC-составе 54.2%. Этот вариант продемонстрировал высокую эффективность при редактировании генома риса [44]. Для экспрессии Cas9 у однодольных растений успешно используются промоторы генов убиквитина кукурузы [44] или риса [53]. Оптимально составленные экспрессионные кассеты позволяют достичь почти абсолютной (до 90% и более) эффективности редактирования локусов-мишеней в трансформантах риса поколения Т0 [50].

В качестве генов селективных маркеров при составлении кассет для редактирования геномов однодольных растений наиболее часто используются гены устойчивости к гигромицину (гигромицинфорсфотрансфераза, HPT) и биалафосу (Bar) под контролем промотора 35S вируса мозаики цветной капусты [44].

 

Системы для мультиплексного редактирования геномов однодольных растений

Мультиплексное редактирование геномов предполагает одновременное нацеливание нуклеазы Cas9 на несколько мишеней. Для этого необходимо ввести в клетку одновременно гены, кодирующие Cas9 и несколько направляющих РНК. Технически сложной задачей является создание генетической конструкции, несущей в составе Т-ДНК одновременно множество генов. С помощью стандартных методов клонирования с использованием различных эндонуклеаз рестрикции возможно собрать T-ДНК вектор, содержащий Cas9 и несколько нРНК под контролем соответствующих промоторов [37]. Однако это требует нескольких этапов клонирования, и может занять продолжительное время. На основе таких способов модульной сборки сложных генетических конструкций, как Golden Gate [54], сборка по Гибсону [55] и MultiSite Gateway [56], несколько групп исследователей создали наборы генетических конструкций-модулей для мультиплексного редактирования CRISPR/Cas, позволяющие собирать сложные экспрессионные кассеты, несущие различные варианты Cas9 и несколько нРНК одновременно. Эти наборы конструкций позволяют производить различные манипуляции в геномах однодольных и двудольных растений, такие как получение множественных нокаутов, индукция делеций и изменение транскрипционной активности генов. На основе полученных наборов векторов были собраны генетические конструкции, содержащие одновременно до 8 нРНК и продемонстрирована их эффективность в клетках и трансгенных растениях риса [44, 57].

С применением клонирования Golden Gate была разработана схема мультиплексного редактирования геномов растений на основе стандарта GoldenBraid [58]. Доступное в сети Internet приложение GoldenBraid CRISPR Domesticator и CRISPR Assembler позволяет in silico промоделировать сборку конструкций для редактирования геномов однодольных и двудольных растений (https://gbcloning.upv.es/tools/crisprs/) с использованием стандартного набора модулей.

Оригинальный подход к мультиплексному редактированию геномов злаков был разработан Xie с соавт. [53]. Авторами предложено использовать эндогенную систему процессинга тРНК для синтеза одновременно нескольких нРНК с одного искусственного полицистронного гена. В норме у эукариот тРНК образуется из РНК-предшественника путем расщепления по определенным сайтам специфическими РНКазами (РНКаза Р и РНКаза Z). Гены тРНК экспрессируются с высокой эффективностью, и системы процессинга тРНК работают с высокой точностью во всех клетках, поэтому использование этого механизма выглядит привлекательным для синтеза искусственных РНК. Было показано, что химерный транскрипт, в котором чередуются тРНК и нРНК, эффективно расщепляется in vivo по сайтам расщепления тРНК, высвобождая оба типа молекул РНК. Причем, уровень накопления нРНК при таком способе синтеза выше, чем без тРНК. Был предложен метод сборки химерных тРНК-нРНК конструкций при помощи ПЦР и системы Golden Gate. Авторы продемонстрировали возможность собрать конструкции, позволяющие синтезировать одновременно до восьми нРНК в составе одного транскрипта. Эффективность полученных векторов была продемонстрирована на протопластах и трансгенных растениях риса. Химерные гены, названные PTG (от polycistronic tRNA-gRNA) при введении в ткани растений вместе с нуклеазой Cas9 с высокой эффективностью индуцировали мутации одновременно во всех сайтах-мишенях и небольшие хромосомные делеции между сайтами [53].

 

ВВЕДЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ КОНСТРУКЦИЙ В КЛЕТКИ РАСТЕНИЙ

Существует два различных подхода к экспрессии искусственных генетических конструкций в клетках растений: транзиентная (временная) экспрессия и стабильная трансформация генома, которая позволяет получать трансгенные растения [59].

Транзиентная экспрессия предполагает введение генетической конструкции одновременно в максимальное число клеток без отбора трансформированных вариантов, что приводит к локальному пику экспрессии трансгена в популяции клеток в течение короткого времени после трансформации. Стабильная трансформация заключается во встройке генетической конструкции в геномную ДНК отдельной растительной клетки, из которой в дальнейшем можно получить трансгенное растение путем регенерации и выращивания на специальных селективных средах. Получение однодольных трансгенных растений занимает продолжительное время, для многих культур трудоемко и сложно технически [60]. Из всех культур однодольных растений наибольшего успеха удалось добиться в трансформации и генной инженерии риса [9]. Большинство работ по редактированию геномов у злаков также были проведены на рисе.

Первые сообщения о редактировании геномов злаков при помощи системы CRISPR/Cas появились в августесентябре 2013 года. Большинство ранних работ были проведены методом транзиентной экспрессии генетических конструкций в клетках растений. Действие системы CRISPR/Cas было продемонстрировано на протопластах пшеницы [61, 62], клетках незрелых эмбрионов сорго [63], протопластах и каллусах риса [63–65], протопластах кукурузы [30]. В это же время появились первые сообщения о трансгенных растениях риса с произведенными мутациями в локусах-мишенях [65, 66], немного позже появились публикации подобных исследований на пшенице [20], ячмене [52] и кукурузе [67].

Генетическая трансформация однодольных растений производится рядом методов, основными из которых являются методы агробактериальной трансформации [9] и биобалистики: бомбардировки частицами, содержащими ДНК, при помощи «генной пушки» [68, 69]. Биобалистика является эффективным методом трансформации, но имеет ряд побочных эффектов, в частности повреждение ДНК и излишне высокое число встроек в геном [68]. Агробактериальная трансформация имеет меньше побочных эффектов, но ее применение у однодольных растений технически сложно и ограничено рядом факторов [9]. Оба метода успешно применялись при редактировании геномов однодольных растений. Агробактериальная трансформация является эффективным способом доставки «инструментов» редактирования в том случае, если желаемые изменения генома задействуют такой механизм репарации как негомологичное сшивание концов. Этим способом успешно проведена редакция геномов растений кукурузы [70, 71], риса [36, 37, 44, 50, 53, 57, 72–74] и ячменя [52]. Биобалистика успешно применялась для пшеницы [20], кукурузы [67] и риса [75]. Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что редактирование геномов риса и кукурузы при задействовании механизма гомологичной рекомбинации проходит намного более эффективно при использовании биобалистики, а не агробактериальной трансформации [67, 75].

Поскольку получение трансгенных однодольных растений – достаточно длительный и трудоемкий процесс, при планировании эксперимента по редактированию генома, имеет смысл сначала протестировать редактирующую систему на популяции клеток (например, на протопластах или каллусах) при помощи транзиентной экспрессии [48]. Это дает возможность быстро оценить эффективность разных вариантов генетических конструкций и выбрать наиболее удачные для продолжения эксперимента и получения трансгенных растений (рис. 3). Такая тактика успешно применялась в ряде работ на рисе [49, 53, 57], кукурузе [70] и пшенице [20].

КОНТРОЛЬ ЭФФЕКТИВНОСТИ РЕДАКТИРОВАНИЯ ГЕНОМА

После трансформации растительных клеток генетическими конструкциями, несущими элементы системы CRISPR/Cas9, необходимо провести оценку эффективности метода. Количественная оценка заключается в определении доли мутировавших клеток в случае работы с клеточной культурой или соотношения растений, несущих и не несущих мутации в целевом локусе при получении трансгенных растений. Качественная оценка включает в себя определение типа полученных мутаций. Самым информативным является метод амплификации, клонирования и секвенирования фрагмента геномной ДНК, содержащего последовательность-мишень. Этот метод позволяет точно охарактеризовать полученную мутацию. Однако, если доля трансформированных клеток невелика, и в препарате геномной ДНК преобладает нативный вариант последовательности, секвенирование множества клонов может оказаться длительным и трудоемким. Для обогащения препарата редактированными вариантами и оценки доли мутировавшей ДНК применяют методы, основанные на использовании эндонуклеаз рестрикции и ПЦР [14].

Внесение в нокаутируемый ген одновременно двух двухцепочечных разрывов (за счет мультиплексного редактирования) вызывает делеции, которые легко детектируются методом ПЦР на основе анализа длины продукта амплификации в геле. При этом относительная интенсивность сигналов, соответствующих исходному и мутантному вариантам, будет свидетельствовать об относительном количестве клеток, в которых произошла делеция [53, 57].

При оценке эффективности мутагенеза у растений, в том числе однодольных, широко применяется метод утраты сайта рестрикции [76], обозначаемый, в частности, как PCR/RE [48] или CAPS (cleaved amplified polymorphic sequence, [77]). Последовательность-мишень подбирается таким образом, что ее 3’-район, в котором происходит двухцепочечный разрыв, содержит сайт узнавания эндонуклеазой рестрикции. Если в данном сайте возникает мутация, он перестает узнаваться специфической эндонуклеазой. После амплификации фрагмента геномной ДНК, содержащей последовательность-мишень, наработанный фрагмент подвергается гидролизу соответствующей эндонуклеазой рестрикции. Нативные последовательности гидролизуются, в результате чего на гель-электрофорезе визуализируются два сигнала. Модифицированная последовательность эндонуклеазой рестриции не узнается, ей соответствует один сигнал. Если образец ДНК содержит смесь нативных и мутантных вариантов, то в геле после электрофоретического разделения будут видны три фрагмента ДНК: два более коротких соответствуют расщепленной нативной последовательности ДНК, а более длинный соответствует мутантным вариантам. Относительная яркость сигналов на гель-электрофорезе свидетельствует о соотношении нативной и мутантной ДНК и свидетельствует об эффективности мутагенеза.

Второй подобный метод, эффективно применяющийся на однодольных растениях, заключается не в потере, а в образовании нового сайта узнавания эндонуклеазой рестрикции в районе мутации [78]. Этот метод обозначают в соответствии с используемыми нуклеазами, например, surveyor [70] или Т7Е1 [15, 20, 48]. Определенные нуклеазы распознают и гидролизуют неточно спаренную ДНК. Для детекции мутаций амплифицируется фрагмент, содержащий “мишень’, затем производится денатурация и последующая ренатурация продуктов амплификации, в результате чего между нативными и мутантными фрагментами могут образовываться гетеродимеры, содержащие отдельные неспаренные нуклеотиды. Эти гетеродимеры гидролизуются нуклеазой с образованием фрагментов, детектируемых в агарозном геле.

Во всех случаях, когда фрагмент ДНК, выявляется при помощи гель-электрофореза, далее не представляется сложным выделить его, клонировать и секвенировать, что дает возможность точно охарактеризовать мутации.

 

ХАРАКТЕРИСТИКА МУТАЦИЙ В ЦЕЛЕВЫХ ЛОКУСАХ

При секвенировании модифицированных участков ДНК однодольных растений было показано, что в 3’-районе сайта-мишени, чаще всего в позиции -3 от PAM в результате действия системы CRISPR/Cas9 происходят небольшие инсерции, делеции и замены одного или нескольких нуклеотидов [44, 52, 62, 67]. Разные группы исследователей отмечали различное соотношение типов мутаций. У растений риса в одних случаях преобладали инсерции одного нуклеотида, преимущественно А или Т [44, 45], в других делеции одного или нескольких нуклеотидов, вплоть до потери протяженных участков [36, 37]. Существует предположение, что вероятность разных типов мутаций в точке двухцепочечного разрыва зависит от особенностей сайта-мишени [36].

У трансгенных растений риса, трансформированных векторами, содержащими систему CRISPR/Cas9, при высокой эффективности редактирования (более 7080%), наибольшее количество трансформантов Т0 несли биаллельные мутации (более 50%), порядка 2428% несли гомозиготные мутации, до 15% гетерозиготные. Единичные регенеранты были химерами по содержанию типов мутаций [37, 44]. Наблюдаемое количество гомозиготных мутаций оказалось значительно выше, чем ожидаемое, исходя из подсчета вероятности одинаковых независимых мутаций одновременно в двух гомологичных хромосомах. Относительно высокий процент гомозиготных мутаций может свидетельствовать о вовлечении гомологичной рекомбинации в процессы репарации [44].

Была проведена оценка эффективности действия системы CRISPR/Cas при редактировании последовательностей, лежащих в гетерохроматиновых районах генома кукурузы [71]. Было показано, что сайты-мишени в пределах гетерохроматина подвержены мутагенезу, и эффективность редактирования этих сайтов не зависит от активности генов, в которых расположены мишени.

 

ОЦЕНКА НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ СИСТЕМЫ CRISPR/CAS

В ряде работ была проведена оценка неспецифической активности системы CRISPR/Cas у однодольных растений. Детекция неспецифической активности проводилась методами утраты сайта рестрикции [77], секвенирования предсказанных локусов, имеющих гомологию с сайтом-мишенью [36], либо при помощи полногеномного секвенирования [45]. В большинстве работ было показано, что в клетках и растениях риса [36, 45], ячменя [52] и кукурузы [70, 71] система CRISPR/Cas действует с высокой специфичностью. Во многих исследованиях мутации в нецелевых локусах обнаруживались с низкой вероятностью, и только если последовательность отличалась от сайта мишени единичной заменой нуклеотида [36, 45, 52, 71], при этом, в сайтах, отличавшихся от мишени более, чем на один нуклеотид, мутаций выявлено не было [36, 52, 71, 73].

Однако существуют исследования, в которых был продемонстрирован относительно высокий уровень неспецифической активности системы CRISPR/Cas в локусах, имеющих одну и две замены нуклеотидов относительно спейсера нРНК [77, 79]. Используя одну нРНК были получены растения риса, мутантные одновременно по трем локусам: полностью гомологичному спейсеру, имеющему одно несоответствие и имеющему два несоответствия нуклеотидов [77]. Тем же коллективом исследователей позднее был продемонстрирован эффективный метод повышения точности системы CRISPR/Cas и полной элиминации ее неспецифической активности [79]. Авторы использовали вариант Cas9, который вносит одноцепочечные разрывы (nick) вместо двухцепочечных. Для индукции одного двухцепочечного разрыва, требуется, соответственно, две различные нРНК, связывающиеся с последовательностями на разных цепях ДНК. Такая модификация системы CRISPR/Cas оказалась высокоспецифичной и достаточно эффективной у риса, что позволяет предполагать, что ее можно использовать в случае необходимости коррекции отдельных представителей семейств высокогомологичных генов у других однодольных растений.

 

МОДИФИКАЦИИ ГЕНОМОВ ЗЛАКОВ, ПОЛУЧАЕМЫЕ ПРИ ПОМОЩИ CRISPR/CAS9

Нокаут генов

Стратегическим подходом обратной генетики растений, нацеленным на установление функций генов, является получение и характеристика мутантов с «нокаутами» генов. Один из способов получения нокаутов основывается на применении случайного инсерционного мутагенеза с дальнейшим скринингом популяции мутантов [80]. Этот способ не дает возможности получить “нокаут” любого гена у любого организма, его применение ограничивается модельными растениями. Другой способ, применяемый с 2000-х гг. как на модельных, так и на возделываемых видах растений для установления влияния генотипа на фенотип и выявления функционально значимых генов TILLING (Targeting induced local lesions in genomes индуцированные локальные повреждения в геномах [81]) – создание широкого спектра мутантов (как правило, с помощью химического мутагенеза) путем фенотипирования и полногеномного генотипирования, трудоемкий подход с небольшим выходом из-за невысокой частоты и случайного характера индуцируемых мутаций. Инсерционный мутагенез и TILLING особенно мало эффективны в отношении генов, представленных в геноме несколькими копиями, так как для функционального исследования таких генов требуется получение мутаций одновременно в нескольких локусах. Большинство злаковых растений как раз имеют сложные геномы (например, пшеница – аллополиплоид, а кукуруза палеополиплоид), несущие дупликации большой части генов.

Предложенные методы геномного редактирования являются новым подходом обратной генетики, лишенным недостатков предыдущих методов. Во-первых, это методы направленного мутагенеза, позволяющие вместо анализа обширных коллекций случайных мутантов исследовать фенотипы единичных модифицированных растений с нокаутированными генами. Во-вторых, такой метод геномного редактирования как CRISPR/Cas позволяет одновременно инактивировать все копии одного и того же гена при наличии в геноме дупликаций (что особенно важно для зерновых злаков) или целый биосинтетический путь [8].

Подавляющее большинство работ по редактированию геномов однодольных растений, опубликованных к настоящему моменту, посвящены именно получению нокаутов конкретных генов. В таблице 3 представлены успешные примеры получения нокаутов генов культивируемых злаковых растений, имеющих ожидаемый фенотип, с помощью CRISPR/Cas9. В частности, были получены растения с множественными нокаутами генов. При помощи мультиплексного редактирования генома риса одновременно были инактивированы семь генов малоизученного семейства FTL, что привело к появлению фенотипа с ранним увяданием листьев, ингибирован путь синтеза антоцианов, путем нокаута одновременно трех генов [44]. Были получены растения риса, мутантные одновременно по трем генам семейства циклинзависимых киназ (CDKB2, CDKB1 и CDKA2) с использованием только одной нРНК, несущей спейсер, гомологичный консервативному участку [77].

 

Коррекция аминокислотной последовательности белка

У кукурузы [67] и риса [75] была успешно проведена коррекция гена ацетолактатсинтазы (ALS), приведшая к появлению устойчивости к гербицидам. Гербициды, являющиеся производными сульфонилмочевины, ингибируют фермент ацетолактатсинтазу, тем самым блокируя синтез разветвленных аминокислот изолейцина и валина у растений. Ранее было показано, что устойчивость к таким гербицидам, как хлорсульфон и биспирибак натрия, появляется в результате единичной аминокислотной замены в белке ALS.

При помощи биобалистики в каллусы кукурузы и риса были внесены Cas9, нРНК и редактирующая матрица. В качестве редактирующей матрицы использовались одноцепочечные и двухцепочечные олигонуклеотиды, а также плазмидная ДНК, содержащая участок гомологии с геном-мишенью. Редактирующие матрицы содержали единичную целевую замену, а также синонимические замены, которые облегчали последующий анализ результатов редактирования. В результате культивирования на среде с добавлением гербицида, были получены устойчивые каллусы, из которых регенерировали растения, несущие целевую замену в гене ALS. Эти растения демонстрировали устойчивость к гербициду и менделевское наследование модифицированного гена [67, 75].

Точная встройка гена

Методика введения двухцепочечных разрывов в ДНК предоставляет возможность точной встройки гена в конкретную последовательность геномной ДНК. Эта возможность была подтверждена в работе Svitashev с соавт. на кукурузе [67]. В качестве редактирующей матрицы использовался фрагмент ДНК, несущий ген фосфинотрицинацетилтрансферазы под контролем промотора убиквитина, фланкированный фрагментами длиной около 1 т.п.н., гомологичными геномной ДНК с двух сторон от сайта двухцепочечного разрыва. Редактирующая матрица вместе с векторами, несущими нуклеазу Cas9 и направляющую РНК, вводилась в каллусы кукурузы с помощью биобалистики или агробактериальной трансформации. Как биобалистика, так и агробактериальная трансформация вызывали мутации в высоком проценте образцов (>80%), но точная встройка целевого гена была зафиксирована только в случае биобалистики в 2.5 4% проанализированных каллусов. Из каллусов, в которых успешно прошла встройка гена, были получены трансгенные растения. Два из семи проанализированных вариантов содержали единичную встройку целевого гена в точке двухцепочечного разрыва и не содержали генов, экспрессирующих Cas9 и направляющую РНК. Это означает, что транзиентной экспрессии компонентов системы редактирования генома было достаточно для получения желаемой модификации. Встроенные гены наследовались согласно законам Менделя [67].

 

Получение протяженных делеций

Растения с протяженными делециями конкретных хромосомных районов могут служить генетическими моделями для исследований функциональной роли определенных протяженных участков в структурно-функциональной организации хромосом и процессах клеточного деления. Кроме того, создание протяженных делеций может быть полезно при необходимости полного блокирования того или иного метаболического процесса путем одновременного удаления кластеризованных генов, участвующих в генетической регуляции данного процесса. Так, например, в исследованиях на рисе [74] мишенями стали кластеры биосинтетических генов, отвечающих за синтез терпеноидов ряда лабдана. Один кластер расположен на четвертой хромосоме риса, содержит 5 генов и имеет протяженность около 170 т.п.н., другой находится на второй хромосоме, содержит 10 генов и имеет протяженность 245 т.п.н. Направляющие РНК были нацелены на гены, расположенные по краям кластеров. Конструкции, содержащие направляющие РНК и Cas9 были введены в протопласты мезофила риса. Через 48 часов из популяции протопластов выделяли геномную ДНК. Делеции детектировали с помощью ПЦР с праймерами, гомологичными фрагментам геномной ДНК по краям кластера удаляемых генов. В результате делеции отдаленные ранее друг от друга последовательности оказывались в непосредственной близости, что делало возможным амплификацию района между ними. Было показано, что все использованные нРНК успешно индуцируют двуцепочечные разрывы, которые приводят к делеции протяженного региона геномной ДНК.

На основе нРНК, которые использовались в эксперименте на протопластах, и Сas9 были созданы векторы для агробактериальной трансформации, с помощью которых получили трансгенные растения риса. Среди трансформантов были обнаружены отдельные растения, в которых детектировались искомые делеции. Этот эксперимент показал возможность крупных направленных хромосомных изменений у злаков при помощи метода CRISPR/Cas [74].

 

НЕТРАНСГЕННЫЕ РАСТЕНИЯ С ОТРЕДАКТИРОВАННЫМИ ГЕНОМАМИ

Существует несколько подходов к получению свободных от чужеродной ДНК нетрансгенных растений, модифицированных при помощи системы CRISPR/Cas.

Первый способ, не предполагающий внесения чужеродной ДНК в клетку, заключающийся в использовании очищенной формы белка Cas9 и синтезированной in vitro направляющей РНК в качестве инструментов редактирования [83], на однодольных пока еще полностью реализован не был. Однако, частично этот подход был реализован на эмбриональных тканях кукурузы. Было показано, что синтезированная in vitro направляющая РНК, внесенная в клетки трансгенных растений, стабильно экспрессирующих Cas9, индуцировала мутации в сайте-мишени с эффективностью, сопоставимой с действием ДНК-вектора, кодирующего эту РНК [67].

Второй способ заключается в транзиентной экспрессии конструкций, несущих элементы системы CRISPR/Cas, без интеграции их в геномную ДНК. Предполагается, что временное присутствие в клетке нуклеазы и нРНК может быть достаточным для внесения необходимых изменений в геном. В работе Svitashev с соавт. показана возможность реализации этого принципа у однодольных растений [67].

Наиболее простым способом получения нетрансгенных растений с отредактированными геномами является отбор растений поколения Т1 и Т2, которые не унаследовали “служебную” Т-ДНК, но несут мутации в целевых сайтах (рис. 3). В случае, если редактируемые локусы и инсерция Т-ДНК находятся в разных группах сцепления, уже в первом поколении потомков первичных трансформантов можно наблюдать расщепление по наличию инсерции Т-ДНК среди растений, несущих мутации в целевых локусах [36, 45]. Однако экспериментальные данные указывают на нарушения менделевских принципов расщепления целевых мутаций в поколении Т1 [36, 52]. Вероятно, это связано с мозаичностью растений Т0 и с тем, что наличие в геноме активных генов Cas9 и нРНК непрерывно индуцирует новые мутации в интактных последовательностях-мишенях. Среди потомков поколения Т2 уже возможно отобрать растения, свободные от трансгена и несущие желаемое изменение в целевом локусе [36, 52, 74]. Было показано, что изменения в геномной ДНК, произведенные при помощи системы CRISPR/Cas, наследуются в соответствии с законами Менделя в отсутствие инсерции Т-ДНК, кодирующей «инструменты» редактирования [36, 52, 67, 70]. При помощи этого метода были получены нетрансгенные растения риса [36], ячменя [52] и кукурузы [70] с отредактированной геномной ДНК.

 

ПЕРСПЕКТИВЫ ПРИМЕНЕНИЯ СИСТЕМЫ CRISPR/CAS У РАСТЕНИЙ

Применение системы CRISPR/Cas на хозяйственно значимых растениях имеет широкие перспективы как в фундаментальных исследованиях, так и для решения прикладных задач. Одной из основных перспектив является возможность значительного ускорения многих исследований, связанных с выяснением функций генов и генетического контроля признаков. В схему исследований можно одновременно включить нокаут одного или нескольких генов, встройку гена в определенную точку генома, направленное усиление или супрессию экспрессии отдельных генов, динамическую визуализацию геномных локусов in situ. Поскольку система CRISPR/Cas позволяет одновременно влиять на несколько локусов, это значительно упрощает исследования взаимодействия генов, характеристику регуляторных контуров и построение генных сетей [35]. Предполагается, что дальнейшие модификации Cas9 и нРНК позволят оказывать воздействия на структуру хроматина и гены, кодирующие служебные РНК, что означает переход от геномной к эпигеномной инженерии [84–86].

Система CRISPR/Cas предоставляет обширные возможности для развития технологий создания трансгенных растений. В настоящее время методы генной инженерии, цис- и трансгенеза широко применяются в биотехнологии растений. Одной из проблем является присутствие в геномах трансгенных растений “служебной” чужеродной ДНК. Система CRISPR/Cas позволяет легко удалять нежелательные последовательности из генома. Также существует необходимость создания растений со встройками множества генов, для получения вариантов растений одновременно с несколькими признаками, или для моделирования дополнительных метаболических путей и циклов. Получение растения со множественными трансгенами методами классического трансгенеза требует использования множества селективных маркеров и проведения серии скрещиваний. Использование методов геномной инженерии позволяет осуществлять последовательные встройки разных трансгенов в определенный локус, без переноса лишней чужеродной ДНК. Таким методом можно создавать искусственные кластеры генов, определяющие целевую группу признаков или сложный признак, располагающиеся в одной группе сцепления, что облегчает дальнейшую селекционную работу с полученными растениями [87].

Перспектива использования технологии CRISPR/Cas в хозяйственных и селекционных целях требует тщательного обсуждения и анализа рисков и преимуществ [88]. С одной стороны, этот метод позволяет вносить точные мутации и получать растения, неотличимые от полученных классическими методами селекции, в том числе с применением ненаправленного мутагенеза. С другой стороны, сохраняется вероятность off-target активности. Кроме того, метод использует технику трансгенеза и рекомбинантные технологии, и потенциально несет риски, связанные с их применением: случайные повреждения ДНК и встройки фрагментов вектора в геном. Некоторые типы модификаций несут те же риски, что и трансгенез: в случае модификации с приобретением устойчивости к патогенам или гербициду возникают экологические риски и риск утечки модифицированного гена в природные популяции. Сложной представляется оценка off-target активности системы. Она была проведена в относительно небольшом количестве работ. Методы оценки off-target активности могут давать противоречивые результаты, поскольку случайные точечные мутации и естественный полиморфизм невозможно отличить от off-target эффектов. Для устойчивого внедрения технологии CRISPR/Cas в селекционную практику требуется принятие ряда процедур, позволяющих оценить и проконтролировать риски в каждом конкретном случае.

 

ЗАКОНОДАТЕЛЬНОЕ РЕГУЛИРОВАНИЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ГЕНОМНОЙ ИНЖЕНЕРИИ ПРИ ПОЛУЧЕНИИ СОРТОВ КУЛЬТУРНЫХ РАСТЕНИЙ

Возможность использовать геномную инженерию при создании сортов культурных растений зависит от законодательного регулирования применения этих методов на национальном и международном уровне. Остаются открытым основной вопрос, будут ли такие растения подпадать под определение генетически модифицированных организмов (ГМО), использование которых в ряде стран жестко ограничено [18, 89, 90].

Ряд изменений генома, получаемых методами геномной инженерии (точечные мутации, небольшие делеции) неотличимы от естественных мутаций [90]. Сайт-специфический мутагенез, получение нокаутов, а также коррекция аминокислотной последовательности гена не предполагают внесения чужеродной ДНК в геном, и задействуют только естественные механизмы репарации. Эти методы можно интерпретировать как методы мутагенеза. Растения, полученные с помощью различных методов мутагенеза, в большинстве случаев не подпадают под ограничения, наложенные на использование ГМО. В США, где принята продукт-ориентированная концепция (которая в меньшей степени принимает в рассмотрение методы получения и фокусируется на оценке конечных свойств продукта), уже определено, что растения, полученные методами геномного редактирования и не содержащие чужеродной ДНК, ГМО не являются. В Европе [91] и России [92] решения принимаются сложнее, поскольку в этих регионах принята процесс-ориентированная концепция, которая предполагает считать ГМО любые организмы, полученные неестественным путем, включая рекомбинантные технологии и технологии переноса генов (но исключая методы химического и радиационного мутагенеза). Согласно этому определению, растения с отредактированными геномами являются ГМО [89, 91, 93]. Тем не менее, высокая биобезопасность и точность подхода, идентичность вносимых изменений естественным мутациям и широчайшие перспективы его применения в селекции сельскохозяйственных культур порождают активную дискуссию о возможности исключить ряд методов геномной инженерии из-под ограничений, наложенных на использование ГМО, или пересмотреть свод правил, регулирующих применение рекомбинантных технологий для получения организмов с новыми свойствами [93].

В случае исключения организмов, полученных методами геномной инженерии и не содержащих чужеродной ДНК, из группы ГМО, можно ожидать быстрого прогресса в улучшении свойств существующих сортов культурных растений, в том числе имеющих стратегическое значение зерновых злаков.

Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (проект 16-14-00086).

 

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

 

  1. Meyer R.S., Purugganan M.D. Evolution of crop species: genetics of domestication and diversification // Nat. Rev. Genet. 2013. V. 14. P. 840–852.
  2. Гончаров Н.П., Шумный В.К. Mетоды генетики в селекции растений: к 80-летию Сибирского НИИ растениеводства и селекции // Вестник ВОГиС. 2006. Т. 10, №2. С. 395–403.
  3. Хлесткина Е.К., Пшеничникова Т.А., Усенко Н.И., Отмахова Ю.С. Перспективные возможности использования молекулярно-генетических подходов для управления технологическими свойствами зерна пшеницы в контексте цепочки “зерно – мука – хлеб”// Вавиловский журнал генетики и селекции. 2016. Т. 20. № 4. doi: 10.18699/VJ15.140.
  4. Леонова И.Н. Молекулярные маркеры: использование в селекции зерновых культур для идентификации, интрогрессии и пирамидирования генов // Вавиловский журнал генетики и селекции. 2013. Т. 17, № 2. C. 314–325.
  5. Орловская О.А., Леонова И.Н., Адонина И.Г., Салина Е.А., Хотылева Л.В., Шумный В.К. Молекулярно-цитогенетический анализ линий тритикале и пшеницы с интрогрессиями генетического материала видов трибы Тriticeae // Вавиловский журнал генетики и селекции. 2015. Т. 19. №5. С. 552-560. doi 10.18699/VJ15.072.
  6. Schaart J.G., van de Wiel C.C.M., Lotz L.A.P., Smulders M.J. Opportunities for products of new plant breeding techniques // Trends Plant Sci. 2015. V. 21. P. 438–449.
  7. Baltes N.J., Voytas D.F. Enabling plant synthetic biology through genome engineering // Trends Biotechnol. 2015. V. 33. P. 120–131.
  8. Voytas D.F., Gao C., McCouch S.R. Precision genome engineering and agriculture: opportunities and regulatory challenges // PLoS Biol. 2014. V.12: e1001877.
  9. Hiei Y., Ishida Y., Komari T. Progress of cereal transformation technology mediated by Agrobacterium tumefaciens // Front. Plant Sci. 2014. V.5. doi: 10.3389/fpls.2014.00628
  10. McKevith B. Nutritional aspects of cereals // Nutr. Bull. 2004. V. 29. P. 111–142.
  11. Шумный В.К., Колчанов Н.А., Сакович Г.В., Пармон В.Н., Вепрев С.Г., Нечипоренко Н.Н., Горячковская Т.Н., Брянская А.В., Будаева В.В., Железнов А.В., Железнова Н.Б., Золотухин В.Н., Митрофанов Р.Ю., Розанов А.С., Сорокина К.Н., Слынько Н.М., Яковлев В.А., Пельтек С.Е. Поиск возобновляемых источников целлюлозы для многоцелевого использования // Вестник ВОГиС. 2010. V. 14. С. 569–578.
  12. Puchta H., Fauser F. Gene targeting in plants: 25 years later // Int. J. Dev. Biol. 2013. V. 57. P. 629–637.
  13. Puchta H. The repair of double-strand breaks in plants: mechanisms and consequences for genome evolution // J. Exp. Bot. 2005. V. 56. P. 1–14.
  14. Voytas D.F. Plant genome engineering with sequence-specific nucleases // Annu. Rev. Plant Biol. 2013. V. 64. P. 327–350.
  15. Bortesi L., Fischer R. The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond // Biotechnol. Adv. 2015. V. 33. P. 41–52.
  16. Quétier F. The CRISPR-Cas9 technology: Closer to the ultimate toolkit for targeted genome editing // Plant Sci. 2016. V. 242. P. 65–76.
  17. Sprink T., Metje J., Hartung F. Plant genome editing by novel tools: TALEN and other sequence specific nucleases // Curr. Opin. in Biotechnol. 2015. V. 32. P. 47–53.
  18. Wolt J.D., Wang K., Yang B. The regulatory status of genome-edited crops // Plant Biotechnol. J. 2016. V. 14. P. 510–518.
  19. Li T., Liu B., Spalding M.H., Weeks D.P., Yang B. High-efficiency TALEN-based gene editing produces disease-resistant rice // Nature Biotechnol. 2012. V. 30. P. 390–392.
  20. Wang Y., Cheng X., Shan Q., Zhang Y., Liu J., Gao C., Qiu J.L. Simultaneous editing of three homoeoalleles in hexaploid bread wheat confers heritable resistance to powdery mildew // Nature Biotechnol. 2014. V. 32. P. 947–951.
  21. Shukla V.K., Doyon Y., Miller J.C., DeKelver R.C., Moehle E., Worden S.E., Mitchell J.C., Arnold N.L., Gopalan S., Meng X., Choi V.M., Rock J.M., Wu Y.-Y., Katibah G.E., Zhifang G., McCaskill D., Simpson M.A., Blakeslee B., Greenwalt S., Butler H.J., Hinkley S.J., Zhang L., Rebar E.J., Gregory P.D., Urnov F.D. Precise genome modification in the crop species Zea mays using zinc-finger nucleases // Nature. 2009. V. 459. P. 437–441.
  22. Djukanovic V., Smith J., Lowe K., Yang M., Gao H., Jones S., Nicholson M.G., West A., Lape J., Bidney D., Carl Falco S., Jantz D., Alexander Lyznik L. Male-sterile maize plants produced by targeted mutagenesis of the cytochrome P450-like gene (MS26) using a re-designed I- Cre I homing endonuclease // Plant J. 2013. V. 76. P. 888–899.
  23. Gao H., Smith J., Yang M., Jones S., Djukanovic V., Nicholson M.G., West A., Bidney D., Falco S.C., Jantz D., Lyznik L.A. Heritable targeted mutagenesis in maize using a designed endonuclease // Plant J. 2010. V. 61. P. 176–187.
  24. Watanabe K., Breier U., Hensel G., Kumlehn J., Schubert I., Reiss B. Stable gene replacement in barley by targeted double-strand break induction // J. Exp. Bot. 2016. V. 67. P. 1433–1445.
  25. Ainley W.M., Sastry-Dent L., Welter M.E., Murray M.G., Zeitler B., Amora R., Corbin D.R., Miles R.R., Arnold N.L., Strange T.L., Simpson M.A., Cao Z., Carroll C., Pawelczak K.S., Blue R., West K., Rowland L.M., Perkins D., Samuel P., Dewes C.M., Shen L., Sriram S., Evans S.L., Rebar E.J., Zhang L., Gregory P.D., Urnov F.D., Webb S.R., Petolino J.F. Trait stacking via targeted genome editing // Plant Biotechnol. J. 2013. V. 11. P. 1126–1134.
  26. Wendt T., Holm P.B., Starker C.G., Christian M., Voytas D.F., Brinch-Pedersen H., Holme I.B. TAL effector nucleases induce mutations at a pre-selected location in the genome of primary barley transformants // Plant Mol. Biol. 2013. V. 83. P. 279–285.
  27. Gurushidze M., Hensel G., Hiekel S., Schedel S., Valkov V., Kumlehn J., Candela H. True-breeding targeted gene knock-out in barley using designer TALE-nuclease in haploid cells // PLoS ONE. 2014. V. 9: e92046.
  28. Budhagatapalli N., Rutten T., Gurushidze M., Kumlehn J., Hensel G. Targeted modification of gene function exploiting homology-directed repair of TALEN-mediated double-strand breaks in barley // Genes, Genomes, Genet. 2015. V. 5. P. 1857–1863.
  29. Shan Q., Wang Y., Chen K., Liang Z., Li J., Zhang Y., Zhang K., Liu J., Voytas D.F., Zheng X., Zhang Y., Gao C. Rapid and efficient gene modification in rice and Brachypodium using TALENs // Mol. Plant. 2013. V. 6. P. 1365–1368.
  30. Liang Z., Zhang K., Chen K., Gao C. Targeted mutagenesis in Zea mays using TALENs and the CRISPR/Cas system // J. Genet. Genomics. 2014. V. 41. P. 63–68.
  31. Char S.N., Unger-Wallace E., Frame B., Briggs S.A., Main M., Spalding M.H., Vollbrecht E., Wang K., Yang B. Heritable site-specific mutagenesis using TALENs in maize // Plant Biotechnol. J. 2015. V. 13. P. 1002–1010.
  32. Belhaj K., Chaparro-Garcia A., Kamoun S., Patron N.J., Nekrasov V. Editing plant genomes with CRISPR/Cas9 // Curr. Opin. Biotechnol. 2015. V. 32. P. 76–84.
  33. Schaeffer S.M., Nakata P.A. CRISPR/Cas9-mediated genome editing and gene replacement in plants: Transitioning from lab to field // Plant Sci. 2015. V. 240. P. 130–142.
  34. Schiml S., Puchta H. Revolutionizing plant biology: multiple ways of genome engineering by CRISPR/Cas // Plant Methods. 2016. V. 12. doi: 10.1186/s13007-016-0103-0
  35. Liu D., Hu R., Palla K.J., Tuskan G.A., Yang X. Advances and perspectives on the use of CRISPR/Cas9 systems in plant genomics research // Curr. Opin. Biotechnol. 2016. V. 30. P. 70–77.
  36. Xu R.F., Li H., Qin R.Y., Li J., Qiu C.H., Yang Y.C., Ma H., Li L., Wei P.C., Yang J.B. Generation of inheritable and “transgene clean” targeted genome-modified rice in later generations using the CRISPR/Cas9 system // Sci. Rep. 2015. V. 5. doi: 10.1038/srep11491
  37. Liang G., Zhang H., Lou D., Yu D. Selection of highly efficient sgRNAs for CRISPR/Cas9-based plant genome editing // Sci. Rep. 2016. V. 6. doi:10.1038/srep21451
  38. Naito Y., Hino K., Bono H., Ui-Tei K. CRISPRdirect: software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites // Bioinformatics. 2015. V. 31. P. 1120–1123.
  39. Xie K., Zhang J., Yang Y. Genome-wide prediction of highly specific guide RNA spacers for CRISPR–Cas9-mediated genome editing in model plants and major crops // Mol. Plant. 2014. V. 7. P. 923–926.
  40. Lei Y., Lu L., Liu H.Y., Li S., Xing F., Chen L.L. CRISPR-P: a web tool for synthetic single-guide RNA design of CRISPR-system in plants // Mol. Plant. 2014. V. 7. P. 1494–1496.
  41. Heigwer F., Kerr G., Boutros M. E-CRISP: fast CRISPR target site identification // Nat. Methods. 2014. V. 11. P. 122–123.
  42. Bae S., Park J., Kim J.-S. Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases // Bioinformatics. 2014. V. 30. P. 1473–1475.
  43. Park J., Bae S., Kim J. Cas-Designer: a web-based tool for choice of CRISPR-Cas9 target sites // Bioinformatics. 2015. V. 31. P. 4014-4016.
  44. Ma X., Zhang Q., Zhu Q., Liu W., Chen Y., Qiu R., Wang B., Yang Z., Li H., Lin Y., Xie Y., Shen R., Chen S., Wang Z., Chen Y., Guo J., Chen L., Zhao X., Dong Z., Liu Y.-G. A Robust CRISPR/Cas9 System for convenient, high-efficiency multiplex genome editing in monocot and dicot plants // Mol. Plant. 2015. V. 8. P. 1274–1284.
  45. Zhang H., Zhang J., Wei P., Zhang B., Gou F., Feng Z., Mao Y., Yang L., Zhang H., Xu N., Zhu J.-K. The CRISPR/Cas9 system produces specific and homozygous targeted gene editing in rice in one generation // Plant Biotechnol. J. 2014. V. 12. P. 797–807.
  46. Hu X., Wang C., Fu Y., Liu Q., Jiao X., Wang K. Expanding the range of CRISPR/Cas9 genome editing in rice // Mol. Plant. 2016. V. 9. P. 943–945.
  47. Koo T., Lee J., Kim J.S. Measuring and reducing off-target activities of programmable nucleases including CRISPR-Cas9 // Mol. Cells. 2015. V. 38. P. 475–481.
  48. Shan Q., Wang Y., Li J., Gao C. Genome editing in rice and wheat using the CRISPR/Cas system // Nat. Protocols. 2014. V. 9. P. 2395–2410.
  49. Xing H.L., Dong L., Wang Z.P., Zhang H.Y., Han C.Y., Liu B., Wang X.C., Chen Q.J. A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants // BMC Plant Biol. 2014. V. 14. doi: 10.1186/s12870-014-0327-y
  50. Mikami M., Toki S., Endo M. Comparison of CRISPR/Cas9 expression constructs for efficient targeted mutagenesis in rice // Plant Mol. Biol. 2015. V. 88. P. 561–572.
  51. Belhaj K., Chaparro-Garcia A., Kamoun S., Nekrasov V. Plant genome editing made easy: targeted mutagenesis in model and crop plants using the CRISPR/Cas system // Plant Methods. 2013. V. 9. doi: 10.1186/1746-4811-9-39
  52. Lawrenson T., Shorinola O., Stacey N., Li C., Østergaard L., Patron N., Uauy C., Harwood W. Induction of targeted, heritable mutations in barley and Brassica oleracea using RNA-guided Cas9 nuclease // Genome Biol. 2015. V.16. doi: 10.1186/s13059-015-0826-7
  53. Xie K., Minkenberg B., Yang Y. Boosting CRISPR/Cas9 multiplex editing capability with the endogenous tRNA-processing system // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2015. V. 112. P. 3570–3575.
  54. Engler C., Kandzia R., Marillonnet S., El-Shemy H.A. A One pot, one step, precision cloning method with high throughput capability // PLoS ONE. 2008. V. 3: e3647.
  55. Gibson D.G., Young L., Chuang R.-y., Venter J.C., Hutchison C.a., Smith H.O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases // Nat. Methods. 2009. V. 6. P. 343–345.
  56. Katzen F. Gateway(®) recombinational cloning: a biological operating system // Expert Opin. Drug Discov.  2007. V. 2. P. 571–589.
  57. Lowder L.G., Zhang D., Baltes N.J., Paul J.W., Tang X., Zheng X., Voytas D.F., Hsieh T.F., Zhang Y., Qi Y. A CRISPR/Cas9 toolbox for multiplexed plant genome editing and transcriptional regulation // Plant Physiol. 2015. V. 169. P. 971–985.
  58. Vazquez-Vilar M., Bernabé-Orts J.M., Fernandez-del-Carmen A., Ziarsolo P., Blanca J., Granell A., Orzaez D. A modular toolbox for gRNA–Cas9 genome engineering in plants based on the GoldenBraid standard // Plant Methods. 2016. V. 12. doi: 10.1186/s13007-016-0101-2
  59. Anami S., Njuguna E., Coussens G., Aesaert S., van Lijsebettens M. Higher plant transformation: principles and molecular tools // Int. J. Dev. Biol. 2013. V. 57. P. 483–494.
  60. Данилова С.А. Методы генетической трансформации зерновых культур // Физиология Растений. 2007. Т. 54. С. 645–658.
  61. Shan Q., Wang Y., Li J., Zhang Y., Chen K., Liang Z., Zhang K., Liu J., Xi J.J., Qiu J.-L., Gao C. Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR-Cas system // Nat. Biotechnol. 2013. V. 31. P. 686–688.
  62. Upadhyay S.K., Kumar J., Alok A., Tuli R. RNA-guided genome editing for target gene mutations in wheat // Genes, Genomes, Genet. 2013. V. 3. P. 2233–2238.
  63. Jiang W., Zhou H., Bi H., Fromm M., Yang B., Weeks D.P. Demonstration of CRISPR/Cas9/sgRNA-mediated targeted gene modification in Arabidopsis, tobacco, sorghum and rice // Nucleic Acids Res. 2013. V. 41. doi:10.1093/nar/gkt780
  64. Xie K., Yang Y. RNA-guided genome editing in plants using a CRISPR–Cas system // Mol. Plant. 2013. V. 6. P. 1975–1983.
  65. Miao J., Guo D., Zhang J., Huang Q., Qin G., Zhang X., Wan J., Gu H., Qu L.J. Targeted mutagenesis in rice using CRISPR-Cas system // Cell Res. 2013. V. 23. P. 1233–1236.
  66. Mao Y., Zhang H., Xu N., Zhang B., Gou F., Zhu J.K. Application of the CRISPR–Cas system for efficient genome engineering in plants // Mol. Plant. 2013. V. 6. P. 2008–2011.
  67. Svitashev S., Young J.K., Schwartz C., Gao H., Falco S.C., Cigan A.M. Targeted mutagenesis, precise gene editing, and site-specific gene insertion in maize using Cas9 and guide RNA // Plant Physiol. 2015. V. 169. P. 931–945.
  68. Rivera A.L., Gómez-Lim M., Fernández F., Loske A.M. Physical methods for genetic plant transformation // Phys. Life Rev. 2012. V. 9. P. 308–345.
  69. Ji Q., Xu X., Wang K. Genetic transformation of major cereal crops // Int. J. Dev. Biol. 2013. V. 57. P. 495–508.
  70. Zhu J., Song N., Sun S., Yang W., Zhao H., Song W., Lai J. Efficiency and inheritance of targeted mutagenesis in maize using CRISPR-Cas9 // J. Genet. Genomics. 2016. V. 43. P. 25–36.
  71. Feng C., Yuan J., Wang R., Liu Y., Birchler J.A., Han F. Efficient targeted genome modification in maize using CRISPR/Cas9 system // J. Genet. Genomics. 2016. V. 43. P. 37–43.
  72. Ikeda T., Tanaka W., Mikami M., Endo M., Hirano H.Y. Generation of artificial drooping leaf mutants by CRISPR-Cas9 technology in rice // Genes Genet. Syst. 2015. V. 90. P. 231–235.
  73. Xu R., Li H., Qin R., Wang L., Li L., Wei P., Yang J. Gene targeting using the Agrobacterium tumefaciens-mediated CRISPR-Cas system in rice // Rice. 2014. V. 7. doi: 10.1186/s12284-014-0005-6
  74. Zhou H., Liu B., Weeks D.P., Spalding M.H., Yang B. Large chromosomal deletions and heritable small genetic changes induced by CRISPR/Cas9 in rice // Nucleic Acids Res. 2014. V. 42. P. 10903–10914.
  75. Sun Y., Zhang X., Wu C., He Y., Ma Y., Hou H., Guo X., Du W., Zhao Y., Xia L. Engineering herbicide-resistant rice plants through crispr/cas9-mediated homologous recombination of acetolactate synthase // Mol. Plant. 2016. doi: 10.1016/j.molp.2016.01.001
  76. Jenkins G. The restriction site mutation assay: a review of the methodology development and the current status of the technique // Mutagenesis. 1999. V. 14. P. 439–448.
  77. Endo M., Mikami M., Toki S. Multigene knockout utilizing off-target mutations of the CRISPR/Cas9 system in rice // Plant Cell Physiol. 2015. V. 56. P. 41–47.
  78. Qiu P., Shandilya H., D’Alessio J.M., O’Connor K., Durocher J., Gerard G.F. Mutation detection using Surveyor nuclease // BioTechniques. 2004. V. 36. P. 702–707.
  79. Mikami M., Toki S., Endo M. Precision targeted mutagenesis via Cas9 paired nickases in rice // Plant Cell Physiol. 2016. doi: 10.1093/pcp/pcw049
  80. Jeon JS., Lee S., Jung K.H., Jun S.H., Jeong D.H., Lee J., Kim C., Jang S., Lee S., Yang K., Nam J., An K., Han M.J., Sung R.J., Choi H.S., Yu J.H., Choi J.H., Cho S.Y., Cha S.S., Kim S.I., An G. T-DNA insertional mutagenesis for functional genomics in rice // Plant J. 2000. V. 22. P. 561–570.
  81. McCallum C.M., Comai L., Greene E.A., Henikoff S. Targeted screening for induced mutations // Nat. Biotechnol. 2000. V. 18. P. 455–457.
  82. Feng Z., Zhang B., Ding W., Liu X., Yang D.L., Wei P., Cao F., Zhu S., Zhang F., Mao Y., Zhu J.K. Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system // Cell Res. 2013. V. 23. P. 1229–1232.
  83. Kanchiswamy C.N., Malnoy M., Velasco R., Kim J.S., Viola R. Non-GMO genetically edited crop plants // Trends Biotechnol. 2015. V. 33. P. 489–491.
  84. Puchta H. Using CRISPR/Cas in three dimensions: Towards synthetic plant genomes, transcriptomes and epigenomes // Plant J. 2015. doi: 10.1111/tpj.13100
  85. Swinnen G., Goossens A., Pauwels L. Lessons from domestication: targeting cis-regulatory elements for crop improvement // Trends Plant Sci. 2016. V. 21. P. 506–515. http://dx.doi.org/10.1016/j.tplants.2016.01.014
  86. Basak J., Nithin C. Targeting non-coding RNAs in plants with the CRISPR-Cas technology is a challenge yet worth accepting // Front. Plant Sci. 2015. V. 6. P. 1–8.
  87. Petolino J.F., Kumar S. Transgenic trait deployment using designed nucleases // Plant Biotechnol. J. 2016. V. 14. P. 503–509.
  88. Ishii T., Araki M. Consumer acceptance of food crops developed by genome editing // Plant Cell Rep. 2016. V. 35. P. 1–12.
  89. Araki M., Nojima K., Ishii T. Caution required for handling genome editing technology // Trends Biotechnol. 2014. V. 32. P. 234–237.
  90. Jones H.D. Regulatory uncertainty over genome editing // Nat. Plants. 2015. V. 1. P. 14011.
  91. Hartung F., Schiemann J. Precise plant breeding using new genome editing techniques: opportunities, safety and regulation in the EU // Plant J. 2014. V. 78. P. 742–752.
  92. Кузин А. Регулирование оборота генно-модифицированных организмов (ГМО) нормами российского права // Социально-политические науки. 2013, № 1. С. 64–70.
  93. Huang S., Weigel D., Beachy R.N., Li J. A proposed regulatory framework for genome-edited crops // Nat. Genetics. 2016. V. 48. P. 109–111.

 

 

Таблица 1. Опыт применения геномного редактирования на зерновых культурах с использованием мегануклеаз, ZFN и TALEN

 

Название и принцип действия системы

Зерновые культуры, тип произведенной модификации

Мегануклеазы. Эндонуклеазы, с длинной последовательностью сайта узнавания (от 12 до 40 п.н.). Существуют мегануклеазы, которые можно модифицировать, искусственно меняя сайт узнавания.

Кукуруза: мутации в конкретных локусах генома [23], нокаут гена MS26 с приобретением фенотипа мужской стерильности [22].

Ячмень: замена гена при задействовании механизма гомологичной рекомбинации [24].

Нуклеазы типа “цинковых пальцев” (ZFN). Это химерные белки, состоящие из ДНК-связывающего домена типа «цинковых пальцев», и нуклеазного FokI-домена. Для внесения двухцепочечного разрыва в ДНК необходимы две нуклеазы, распознающие сайты по разные стороны от «мишени», чтобы могла произойти димеризация и активация FokI.

Кукуруза: Точная встройка генов [25]. Встройка гена устойчивости к гербициду в кодирующую последовательность гена IPK1, получение растений со сниженным содержанием фитатов, устойчивых к гербициду [21].

TALEN. Химерные белки, состоящие из ДНК-связывающего домена и нуклеазы FokI. ДНК-связывающий домен происходит из белков TALE Xanthamonas sp. и состоит из повторенных последовательностей длиной 33-35 аминокислот. В каждом повторе есть две вариабельные аминокислоты, обеспечивающие связывание с определенным нуклеотидом. Для внесения двухцепочечного разрыва необходим дизайн двух различных нуклеаз, узнающих последовательности по разные стороны от «мишени», что обеспечивает димеризацию и активацию FokI.

Ячмень: мутации в промоторном районе гена HvPAPhy [26]. Получение нокаутов гена-репортера [27]. Коррекция последовательности гена-репортера при задействовании механизма гомологичной рекомбинации [28].

Пшеница: одновременное внесение мутаций в три гомеоаллеля гена TaMLO привело к появлению устойчивости к мучнистой росе [20].

Рис: направленная мутация в промоторном районе гена OsSWEET14 привела к появлению устойчивости к Xanthomonas oryzae [19]. Получены мутации генов OsDEP1, OsCKX2, OsBADH2, OsSD1 в протопластах [29].

Кукуруза: мутации в генах ZmPDS, ZmIPK1A, ZmIPK, ZmMRP4 [30], нокаут гена glossy2, приобретение фенотипа с измененными свойствами поверхности листьев [31].

Таблица 2. Примеры веб-инструментов для дизайна экспериментов по редактированию геномов однодольных культурных растений при помощи системы CRISPR/Cas

Таблица 3. Однодольные растения с нокаутами генов, полученные при помощи системы CRISPR/Cas

 

Вид растения

Ген

Фенотип при нокауте гена

Литературный источник

Рис

 

Семейство генов FTL

Раннее увядание

[44]

OsGSTU, OsMRP15, OsAnP

Нарушение синтеза антоцианов в листьях

OsWaxy

Снижение содержания амилозы

OsPDS

Альбинизм, карликовость

[45, 50, 53, 61]

OsDL

Поникающий лист

[50, 72]

OsYSA

Альбинизм

[57, 82]

OsROC5

Кудрявый лист

[57]

OsBEL

Потеря устойчивости к гербициду

[73]

OsCAO1

Нарушение синтеза хлорофилла

[65]

OsLAZY1

Широкое расположение побегов

Кукуруза

 

Ms26, Ms45

Мужская стерильность

[67]

Psy1

Снижение содержания каротиноидов в эндосперме и листьях

[70]

zb7

Альбинизм

[71]

 

ПОДПИСИ К РИСУНКАМ

Рис. 1. Редактирование геномов при помощи сайт-специфических нуклеаз [15] (с изменениями). Репарация двухцепочечного разрыва может происходить при задействовании механизмов негомологичного сшивания концов (на схеме слева) и гомологичной рекомбинации (на схеме справа).

 

Рис. 2. Система CRISPR/Cas: РНК-направленное расщепление ДНК нуклеазой Cas9 (а), структура нРНК (б) [15, 37]. Пояснения в тексте.

 

Рис. 3. Метод редактирования геномов растений при помощи системы CRISP/Cas9. Светлым выделены этапы получения растений с модифицированными геномами, темным - способы контроля эффективности метода на каждом этапе.