УДК 581.1:574.583(28):591
СЕЗОННАЯ ДИНАМИКА СОСТАВА ЖИРНЫХ КИСЛОТ ЛИПИДОВ ВОДНОГО МХА Fontinalis antipyretica, СОБРАННОГО В РЕКЕ ЕНИСЕЙ
© 2009 г. Г. С. Калачева*, Н. Н. Сущик*, М. И. Гладышев*,**, О. Н. Махутова *
* Институт биофизики Сибирского отделения Российской академии наук, Красноярск
** Сибирский федеральный университет, Красноярск
Поступила в редакцию 15.05.2008 г.
Методом хромато-масс-спектрометрии проведена идентификация и изучена сезонная динамика ЖК липидов водного мха фонтиналиса (Fontinalis antipyretica), обитающего в р. Енисей. Спектр ЖК водного мха характеризовался относительно низким содержанием насыщенных кислот и преобладанием полиненасыщенных кислот (ПНЖК) с двойными связями (более 30% от суммы ЖК) и полиненасыщенных кислот с двойными и тройными связями (ацетиленовых кислот, более 40% от суммы ЖК). Доминирующими ПНЖК являлись α- и γ-линоленовая (18:3ω3 и 18:3ω6), арахидоновая (20:4ω6) и эйкозапентаеновая (20:5ω3) кислоты. Относительное содержание ПНЖК ω3-семейства было максимальным весной, а ПНЖК ω6-семейства достоверно не различалось во все сезоны года. В биомассе фонтиналиса идентифицировано семь ацетиленовых кислот, среди которых доминирующими являлись октадека-9,12-диен-6-иновая (6a,9,12–18:3), октадека-9,12,15-триен-6-иновая (6a,9,12,15–18:4) и эйкоза-11,14-диен-8-иновая (8a,11,14–20:3). Впервые в липидах фонтиналиса была идентифицирована ацетиленовая эйкоза-11,14,17-триен-8-иновая кислота (8a,11,14,15–20:4). Относительное содержание ацетиленовых кислот в сумме ЖК было высоким на протяжении всего исследованного периода с максимальным накоплением летом. Благодаря постоянно высокому содержанию в биомассе водного мха и отсутствию других продуцентов данных кислот в экосистеме, ацетиленовые ЖК являются информативными высокоспецифичными биомаркерами при изучении трофических взаимодействий речной высшей растительности и зообентоса.
--------------------------------------
Сокращения: ам – атомная масса; ВВР – высшая водная растительность; ГХ/MС – газовая хроматография с масс-спектрометрией; ДМОК – диметилоксазолиновые производные ЖК; МНЖК – мононенасыщенные ЖК; МС – масс-спектры; МЭЖК – метиловые эфиры ЖК; ПНЖК – полиненасыщенные ЖК; ТАГ – триацилглицерины.
Адрес для корреспонденции: Калачева Галина Сергеевна. 660036 Красноярск, Академгородок, Институт биофизики Сибирского отделения Российской академии наук. Факс: 007 (3912) 43-34-00; электронная почта: kalach@ibp.ru
 
Ключевые слова: Fontinalis antipyretica – жирные кислоты – ацетиленовые кислоты – сезонная динамика.

ВВЕДЕНИЕ

Как известно, высшая водная растительность (ВВР), а именно мхи и покрытосеменные растения, производит значительную долю первичной продукции в некоторых пресноводных экосистемах, например, в литорали рек с быстрым течением [1]. Однако остается непонятным, являются ли макрофиты только субстратом (убежищем) для различных видов речных первичных консументов – бентосных беспозвоночных и рыб, или же они служат еще и объектами их питания. В отличие от очевидной топической роли, трофическое значение водных макрофитов для первичных консументов практически не исследовано. Изучение спектров питания водных беспозвоночных животных классическим методом микроскопирования содержимого кишечников имеет ряд существенных ограничений; поэтому в последние годы получил распространение метод анализа биохимических маркеров, а именно, ЖК, позволяющий оценить источники не только потребленного, но и ассимилированного органического вещества [2, 3]. Некоторые виды ВВР, такие как водные мхи, обладают высокоспецифичными маркерами (ацетиленовыми ЖК), не синтезируемыми более никакими группами пресноводных гидробионтов [4]. В среднем Енисее одним из распространенных видов ВВР является водный мох фонтиналис (Fontinalis antipyretica) [5].
Некоторые представители водных мхов синтезируют необычные ненасыщенные ЖК с тройной связью [6, 7]. Ацетиленовые кислоты (6a,9,12–18:3; 6a,9,12,15–18:4 и 8a,11,14–20:3) у F. antipyretica впервые были идентифицированы Anderson B. и Anderson W.H. с соавт. [8, 9] в 70-х годах прошлого столетия. В дальнейшем эти результаты были подтверждены и другими авторами [10, 11]. Вместе с тем, в работах Dembitsky с соавт. [6, 12] показана способность мхов, в том числе и фонтиналиса, синтезировать ряд моноеновых и диеновых ацетиленовых кислот.
Целью настоящей работы явилась идентификация ацетиленовых ЖК и изучение сезонных изменений в составе ЖК липидов F. antipyretica, обитающего в среднем участке р. Енисей.

МЕТОДИКА

Объектом исследований являлся водный мох фонтиналис (Fontinalis antipyretica L. ex Hedw.), собранный в течение 2003–2006 гг. в литоральной части р. Енисей, на станции, расположенной выше Красноярска и около 30 км ниже плотины Красноярской ГЭС (5558´ с.ш., 9243΄ в.д.). Вследствие искусственного регулирования гидрологического режима, годовой диапазон температуры на данной станции составляет 0–12С, а в зимний период река в этом районе не замерзает. Основные гидрологические и гидрохимические характеристики реки приведены в работе [13].
 Свежесобранные образцы мха отмывали от обрастаний и мелких беспозвоночных, подсушивали на фильтровальной бумаге, взвешивали и добавляли к ним по 5 мл смеси хлороформа и метанола (2 : 1) и фиксированный объем раствора внутреннего стандарта (нонадекановая кислота, 19:0). Липиды трижды экстрагировали данной смесью растворителей с одновременным механическим разрушением тканей со стеклянными бусами. Объединенные экстракты отмывали от нелипидных примесей и собирали в колбу пропусканием через слой безводного сернокислого натрия. Растворитель отгоняли на роторно-вакуумном испарителе. Липидный экстракт подвергали кислотному метанолизу, как описано в работе [2].
Метиловые эфиры ЖК (МЭЖК) анализировали на газовом хроматографе с масс-спектрометром (ГХ/MС, модель GCD Plus, "Hewlett Packard", США) на капиллярной колонке HP-FFAP длиной 30 м, с внутренним диаметром 0.25 мм. Условия хроматографирования: газ-носитель – гелий; скорость потока – 1 мл/мин; температура ввода проб – 220C; начальная температура – 100C, подъем температуры до 190C со скоростью 3C/мин, 5 мин изотермального режима, далее подъем температуры до 230C со скоростью 10C/мин, и 20 мин изотермального режима; температура интерфейса – 260C; температура источника ионов – 165C; режим электронного удара при 70 эВ; режим сканирования фрагментов с атомной массой (ам) от 45 до 450 при 0.5 с/скан. Идентификацию МЭЖК проводили сравнением их времен удерживания с таковыми имеющихся стандартов (“Serva”, Германия и “Sigma”, США) и по масс-спектрам. Положение двойных и тройных связей в ненасыщенных кислотах определяли после получения диметилоксазолиновых производных фракции ЖК (ДМОК) [14] и последующего хроматографирования их в тех же условиях, что и МЭЖК. Для получения ДМОК к фракции омыляемых липидов добавляли 0.2 мл 2-амино-2-метил-1-пропанола ("Sigma"), раствор продували гелием, плотно закрывали и нагревали до 190С в течение 1.5 ч. После охлаждения реакционную смесь разбавляли дистиллированной водой, подкисляли, и дериваты (ДМОК) экстрагировали гексанацетоновой смесью (96 : 4).
Коэффициенты корреляции r между содержанием разных ЖК вычисляли обычным способом; статистическую достоверность определяли по t-критерию Стьюдента [15]. Затем на основании высоких (> 0.5), статистически достоверных положительных корреляционных связей, был построен корреляционный граф, где были обозначены все основные ЖК и соответствующие связи между ними.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Состав ЖК липидов, выделенных из фонтиналиса, представлен в табл. 1. В спектре ЖК обнаружено 44 компонента, среди которых идентифицированы насыщенные, моноеновые, диеновые, полиеновые ЖК ω3- и ω6-семейств и ацетиленовые ЖК (рис. 1).
Основной насыщенной кислотой являлась пальмитиновая (16:0), относительное содержанием которой колебалось от 7.16 до 15.09% в зависимости от времени сбора образца, и только в октябре 2004 г. доля этой кислоты составляла 28.4%. Относительное содержание остальных насыщенных кислот – миристиновой (14:0), стеариновой (18:0) и более длинноцепочечных – арахиновой (20:0), бегеновой (22:0) и лигноцериновой (24:0) – варьировало от следовых количеств до 3% от суммы ЖК. В незначительных количествах обнаружены короткоцепочечные ЖК, лауриновая и пентадекановая (12:0, 15:0) и в отдельных пробах – длинноцепочечные 21:0, 23:0 и 26:0.
Количество и положение двойных связей в ненасыщенных ЖК были идентифицированы по масс-спектрам МЭЖК и ДМОК. Если МС МЭЖК позволяет определить длину углеродной цепи и количество ненасыщенных связей, то по МС ДМОК в большинстве случаев можно четко идентифицировать положение и качество этих связей, так как фрагментация таких производных приводит к образованию осколков, четко различающихся по мол. м. на 14, 12 или 10 ам в зависимости от насыщенности С–С-связей. Основные характеристики масс-спектров МЭ и ДМОК ненасыщенных кислот, подтверждающие правильность идентификации ЖК, приведены в табл. 2. Молекулярные ионы, базовые пики, диагностические ионы для положения ненасыщенных связей в углеродной цепи совпадали с литературными данными [14, 16] и являлись основанием для идентификации ЖК.
Доля мононенасыщенных кислот (МНЖК) в спектре ЖК колебалась от 5.61 до 10.67% в зависимости от сроков сбора проб. МНЖК были представлены в основном пальмитолеиновой (16:1ω7 – от 0.94 до 5.97%), олеиновой (18:1ω9 – от 0.70 до 3.12%) и вакценовой (18:1ω7 – от следов до 1.33%) кислотами (табл. 1). Относительное содержание транс-3-гексадеценовой кислоты изменялось от 0.05 до 1.83%, а эйкозеновой (20:1ω9) – от следов до 0.28%. В отдельных пробах обнаружена тетракозеновая кислота (24:1ω9).
Основной диеновой кислотой являлась линолевая (18:2ω6), доля которой колебалась от 4.94 до 16.67%. В небольших количествах найдены диеновые кислоты с 16 атомами углерода – это 16:2ω5 (от следов до 0.78%) и 16:2ω4 (от 0.10 до 0.97%).
Среди полиненасыщенных кислот (ПНЖК) липидов фонтиналиса доминировали кислоты ω3-семейства (табл. 1). Так, относительное содержание α-линоленовой кислоты (18:3ω3) колебалось от 7.16 до 17.86%, а эйкозапентаеновой (20:5ω3) – от 0.83 до 6.29%. В значительно меньших количествах идентифицированы стеаридоновая кислота (18:4ω3) – от 0.23 до 1.33% от суммы ЖК; 20:3ω3 (следы – 1.22%); 20:4ω3 (следы – 1.15%) и 22:5ω3 (0.16–2.08%). В отдельных пробах были обнаружены 22:4ω3 и 22:6ω3 кислоты.
ПНЖК ω6-семейства были представлены γ-линоленовой кислотой (18:3ω6), содержание которой варьировало от 0.92 до 4.58%, и арахидоновой (20:4ω6) – от 1.14 до 3.59% от суммы ЖК. Доля ди-гомо-γ-линолевой кислоты (20:3ω6) в некоторых образцах достигала 2.88%, а 22:4ω6 присутствовала в отдельных пробах.
В спектре ЖК липидов фонтиналиса большую долю составляли ацетиленовые кислоты (табл. 1), масс-спектры которых были характерны для полиеновых кислот, содержащих одну или более тройных связей (рис. 2). Ацетиленовые кислоты фонтиналиса представлены семью компонентами, три из которых являлись доминантами. На рис. 2 приведены масс-спектры метиловых эфиров трех основных ацетиленовых кислот. Масс-спектры остальных ацетиленовых компонентов, за исключением одного из них с Vуд. = 38.07 мин, были подобны и характеризовались наличием базового устойчивого иона тропилия с 91 m/z, который образуется в результате перегруппировки ненасыщенных фрагментов молекулы ацетиленовых кислот после электронной ионизации [16].
Молекулярная масса метилового эфира кислоты с временем удерживания Vуд. = 33.20 мин (А1, рис. 1) соответствовала 290 m/z (рис. 2а), что свидетельствовало о том, что кислота содержит 18 атомов углерода и две двойных и одну тройную связь, или две тройных связи. Масс-спектр ДМОК этой кислоты, представленный на рис. 3а, подтвердил, что это С18-кислота, и позволил идентифицировать количество и положение ненасыщенных связей в углеродной цепи. Так, молекулярный ион ДМОК этой кислоты составлял 329, хотя более интенсивен был ион с 328 m/z , что характерно для МС ДМОК ацетиленовых кислот [14, 17]. Диагностическими ионами для определения положения двойных связей в молекуле являлись 192/204 и 232/244 m/z, что соответствовало Δ9- и Δ12-положению. Четкие пары ионов для тройной связи в масс-спектре отсутствовали, но найдены фрагменты, образующиеся при фрагментации углеродной цепи перед, внутри и после тройной связи и соответствующие карбоксильной части молекулы: ионы с 152/166/178 m/z (табл. 2). Наличие этих фрагментов дало основание говорить о локализации тройной связи в Δ6-положении, а кислоту идентифицировать как октадека-9,12-диен-6-иновую (6а,9,12–18:3).
Масс-спектр МЭ второй кислоты был подобен вышеописанному; однако молекулярный ион не проявлялся (рис. 2б). Мол. м. ДМОК этой кислоты составила 327 m/z, что свидетельствовало о введении в молекулу еще одной ненасыщенной связи в Δ15-положение, что подтверждалось наличием дополнительной пары характеристических ионов – 272/284 m/z (табл. 2). Вторая ацетиленовая кислота была идентифицирована как октадека-9,12,15-триен-6-иновая (6а,9,12,15–18:4).
Относительное содержание 6а,9,12–18:3 колебалось в течение всего периода наблюдений от 11.69 до 23.79%, а 6а,9,12,15–18:4 – от 2.52 до 14.44%.
Приблизительно на этом же уровне в спектре ЖК варьировало содержание третьей доминантной ацетиленовой кислоты (от 2.72 до 15.91%) (табл. 1). Масс-спектр, отображенный на рис. 2в, свидетельствовал, что кислота относится к С20 ацетиленовым кислотам, так как ее мол. м. составляла 318 m/z, а базовый пик – 91 m/z. Масс-спектр ДМОК этой кислоты приведен на рис. 3б. В МС четко проявлялись диагностические ионы, которые подтверждали локализацию двойной связи в Δ11- и Δ14-положении (220/232 и 260/272 m/z) и тройной – в Δ8-положении (182/192 m/z) (табл. 2). Следовательно, эта кислота была идентифицирована как эйкоза-11,14-диен-8-иновая (8а,11,1420:3).
Среди минорных ацетиленовых кислот достоверно идентифицирована кислота с Vуд. = 38.45 мин (рис. 1, А7). Основные характеристики масс-спектрального анализа этой кислоты представлены в табл. 2. Молекулярный ион метилового эфира кислоты имел массу 316 m/z, а ДМОК производного – 355 m/z. Диагностические ионы – 300/312; 260/272; 220/232 m/z  соответствовали локализации двойных связей в Δ11-, Δ14- и Δ17-положениях, а 182/192 m/z – присутствию тройной связи в Δ8-положении. Кислота была идентифицирована как эйкоза-11,14,17-триен-8-иновая кислота (8а,11,14,17–20:4). Содержание этой кислоты в спектре ЖК колебалось от следовых количеств до 1.89% в течение всего исследованного периода (табл. 1).
В масс-спектре метилового эфира кислоты с Vуд. = 38.07 мин интенсивность иона тропилия была значительно ниже, чем базового иона 79 m/z (табл. 2). Однако спектр характеризовался наличием высоко интенсивного иона 150 m/z (рис. 4). Этот ион формируется из терминального конца молекулы при разрыве между ω7- и ω8-атомами углерода и характерен для конъюгированных двойной–тройной связей, где двойная связь находится в транс-Δ13-положении [16]. В масс-спектре ДМОК кислоты четко идентифицирован молекулярный ион с 357 m/z, соответствующий С20-кислоте с 4 ненасыщенными связями. Однако выявление положения этих связей по МС ДМОК достаточно затруднено. Можно четко сказать, что между фрагментами с 286 и 208 m/z должны локализоваться или 3 двойных связей, или 1 двойная и 1 тройная связь, так как разность между их массами составляла 78 ам, что на 6 ам меньше, чем если бы связи были насыщенными. Учитывая результаты масс-спектрального анализа МЭЖК и ДМОК производных, можно с большой вероятностью утверждать, что в углеродной цепи этой кислоты в Δ13-положении находится транс-двойная связь, а в Δ11 – тройная связь. Третья двойная связь, возможно, локализуется между 13 и 14 атомами углерода с метильного конца и идентифицирующими фрагментами могут быть 180 и 168 m/z. Таким образом, вероятнее всего, кислота может быть идентифицирована как 7,11а,13t–20:3. Относительное содержание этой необычной ацетиленовой кислоты колебалось от следовых количеств до 1.43% в течение всего периода наблюдений (табл. 1).
ЖК с временами удерживания 33.20 и 34.58 мин идентифицировать пока не удалось, но, возможно, они относятся к изомерам С20-кислот с разным положением ацетиленовых связей (табл. 2). Доля этих кислот в спектре ЖК была невелика и колебалась от следов до 1.03–1.10%.
Корреляционный анализ процентного содержания всех ЖК липидов фонтиналиса, представленный в виде корреляционного графа (рис. 5), выявил пять групп кислот со сходной сезонной динамикой. Первая наиболее представительная группа (группа насыщенных кислот) включала все насыщенные кислоты, транс-3-гексадеценовую кислоту, 16:2ω4 и полиненасыщенные длинноцепочечные 22:5ω3 и 22:4ω6 кислоты. Вторая группа (группа ω3-кислот) была представлена в основном полиненасыщенными кислотами ω3-семейства с длиной углеродной цепи от 16 до 20 и арахидоновой кислотой. Эйкозатетраеновые кислоты ω3- и ω6-семейства достоверно коррелировали с 8а,11,14–20:3 ацетиленовой кислотой. В составе третьей группы (группа ω6-кислот) были олеиновая, линолевая и γ-линоленовая кислоты, которые коррелировали с 20:1ω9 кислоту, а та в свою очередь достоверно коррелировала с 8а,11,14,17–20:4. Ацетиленовые кислоты 6а,9,12–18:3; 6а,9,12,15–18:4 и А4 составляли четвертую группу (группа ацетиленовых кислот). 7,11а,13t–20:3 коррелировала с 20:3ω6, они и были объединены в пятую группу. 16:1ω7, 22:4ω3, 22:6ω3 и А3 имели свою специфическую динамику и не коррелировали ни с одной кислотой.
На рис. 6 представлено среднее содержание отдельных групп ЖК в фонтиналисе в зимние (n = 7), весенние (n = 4), летние (n = 6) и осенние (n = 5) месяцы исследованного трехлетнего периода. Для первой группы насыщенных кислот отмечалось достоверное повышение относительного содержания этих кислот в осенний период по сравнению с летом и зимой (t-критерий Стьюдента был 2.2 и 2.5 соответственно, при p < 0.05). Весной была отмечена недостоверная тенденция к увеличению доли насыщенных кислот.
Синтез кислот второй группы (рис. 6), представленных в основном ω3 ПНЖК фотосинтезирующего аппарата, увеличивался весной и достоверно отличался от летних и осенних проб (t-критерий был 2.7 и 3.3 соответственно, при p < 0.05). Надо отметить, что доля ацетиленовой кислоты в этой группе практически не изменялась зимой, весной и осенью, а летом – несколько снижалась. Однако на общую сезонную динамику кислот второй группы эти изменения не повлияли.
Достоверных отличий в содержании кислот третьей группы (ω6-семейства) не выявлено, хотя средние значения этих показателей были несколько выше зимой и летом.
Наиболее интенсивный синтез ацетиленовых кислот (четвертая группа, рис. 6) отмечен летом (t = 4.5, 3.2 и 2.9 при p < 0.01 соответственно, по сравнению с величинами в весенний, осенний и зимний периоды).
Процентное содержание ЖК пятой группы (рис. 6), представленной минорными ацетиленовой и эйкозатриеновой кислотами, достоверно увеличивалось в зимний и осенний периоды, тогда как весной и летом доля этих кислот составляла менее 1% (t = 4.7, 4.5 и 5.2, 4.95 при p < 0.01 соответственно, при сравнении зимних и осенних проб с пробами весеннего и летнего периода).
Абсолютное суммарное содержание ЖК в водном мхе было максимальным в зимний и летний периоды, составляя 10–12% от сухого веса, в то время как весной этот показатель был на уровне 5–7% (t = 2.5 и 2.4 при p < 0.05 соответственно, при сравнении средних для лета и зимы с таковыми весной). Осенью суммарное содержание ЖК колебалось от 6 до 10% и достоверно не отличалось от средних величин в другие сезоны (рис. 6).

ОБСУЖДЕНИЕ

Способность к синтезу ацетиленовых кислот представителями водного мха F. antipyretica является неоспоримым фактом. Однако качественный состав ацетиленовых кислот, представленный разными авторами, достаточно сильно варьирует. Так, по данным Dembitsky и Rezanka [6, 7] фонтиналис синтезирует моноеновые, диеновые и триеновые кислоты с одной тройной связью (всего 10 компонентов), а Anderson с соавт. [8, 9] обнаружили у F. antipyretica в основном три ацетиленовые кислоты: 6a,9,12–18:3; 6a,9,12,15–18:4 и 8a,11,14–20:3.
Основными ацетиленовыми кислотами фонтиналиса из р. Енисей были 6a,9,12–18:3; 6a,9,12,15–18:4 и 8a,11,14–20:3, что согласуется с данными ряда авторов [8–10]. Однако мох из Енисея синтезирует еще 4 ацетиленовых компонента, относительное содержание которых невелико. Два из этих компонентов идентифицировать пока не удалось, а два представлены ацетиленовыми кислотами С20-ряда – 8а,11,14,17–20:4 и 7,11а,13t–20:3. С20-ацетиленовая кислоты с 4 ненасыщенными связями была обнаружена в липидах фонтиналиса [7]; однако эта кислота отнесена к ω6-семейству с положением ацетиленовой связи в Δ5. Ацетиленовые кислоты с конъюгированными двойнойтройной связями, к которым относится 7,11а,13t–0:3, не обнаруживали ранее во мхах. Однако такие кислоты достаточно хорошо известны и являются компонентами растительных липидов некоторых экзотических растений [17–19].
Таким образом, по составу ацетиленовых кислот липидов F. antipyretica из Енисея отличается от мхов, обитающих в других водоемах. Эти отличия связаны с присутствием минорных ацетиленовых компонентов, таких как 6а,11,14,17–20:4 и 7,11а,13t–20:3. Кроме того, доля ацетиленовых кислот в составе ЖК общего липидного экстракта енисейского мха составляла около 40% и более. Такой высокий уровень ацетиленовых кислот характерен только для триацилглицеринов (ТАГ) фонтиналиса, в общем липидном экстракте содержание этих кислот в несколько раз меньше [7]. В спектре ЖК общих липидов Dicranum scoparium, у которого содержание ТАГ превышало 40%, доля ацетиленовых кислот была выше 44% [20]. По всей вероятности, исследуемый нами мох синтезировал липиды, обогащенные ТАГ. Известно, что фракция нейтральных липидов у бриофитов может составлять от 30 до 85% от общих липидов, а полярных липидов – всего 3–30% [21].
Стимулирующим фактором для синтеза нейтральных липидов может быть среда обитания водного мха на р. Енисей, которая отличается одной, очень важной особенностью – температура воды на протяжении всего года остается низкой и колеблется от 0–4С зимой до 5–12С летом. Известно, что низкие температуры стимулируют синтез запасных липидов у водных бриофитов [22]. Повышение уровня общих липидов и ТАГ наблюдали в субарктическом мхе D. elongatum поздней зимой и весной [23].
В настоящей работе синтез липидов мы оценивали по абсолютному содержанию ЖК, рассчитанному по внутреннему стандарту. Общее содержание ЖК колебалось от 4 до 18% на сухое вещество. Наиболее интенсивный синтез ЖК наблюдался в зимний период, когда температура воды была минимальной, что согласуется с литературными данными [23]. Однако второй максимум накопления ЖК отмечен в летний период, когда температура в реке была на 5С выше. Возможно, в этот период были более благоприятные условия для интенсивного накопления ТАГ, обогащенных ацетиленовыми кислотами. Летом отмечалось увеличение относительного содержания группы ацетиленовых кислот (рис. 6, четвертая группа). Вероятнее всего, усиленный синтез ацетиленовых кислот в летний период обусловлен более высоким уровнем освещенности и более благоприятными температурными условиями. Известно, что увеличение интенсивности света стимулирует введение тройной связи в молекулу ЖК у бриофитов [20, 23], а оптимальной температурой для роста фонтиналиса является 15–20С [24].
Для состава ЖК липидов F. antipyretica из Енисея характерно низкое содержание насыщенных кислот (около 10–12% от суммы ЖК), что в 3 раза ниже данных, известных для фонтиналиса из другого водоема [7]. Насыщенность липидов достоверно повышалась в осенний период (рис. 6, первая группа), что сопровождалось снижением содержания в биомассе суммарных ЖК и отдельных групп ненасыщенных кислот. Относительное содержание моноеновых кислот в липидах фонтиналиса не превышало 10% и изменялось незначительно в течение всего исследованного периода. Эта фракция ЖК не отличалась большим разнообразием изомеров в отличие от того же вида, описанного Dembitsky и Rezanka [7, 11]. Основными моноенами были пальмитолеиновая, транс-3-гексадеценовая, олеиновая и вакценовая кислоты. В отличие от фонтиналиса из озера Самарской Луки, енисейский мох синтезировал весь набор С16-кислот – моноены, диены, триены и тетраены. Триеновая и тетраеновая С16-кислоты относились к ω3-семейству, а гексадекадиеновая кислота представлена двумя изомерами. Изомер ω4 является обычным компонентом фотосинтезирующих организмов, а ω5 – достаточно редкий изомер 16:2 кислот. Однако такие изомеры были найдены в липидах некоторых альпийских растений Памира [25].
Основными полиненасыщенными кислотами фонтиналиса из Енисея являются α- и γ-линоленовая, арахидоновая и эйкозапентаеновая кислоты. Пентаеновая кислота с 22 атомами углерода определена в липидах мха впервые, а докозагексаеновая кислота, так же как 22:4ω6, встречающиеся в отдельных пробах фонтиналиса, вероятно, выделены случайно. Их источниками могут быть представители микрозоопланктона, населяющие заросли мха.
Таким образом, состав полиеновых кислот исследованного нами мха характерен для представителей бриофитов [7, 11, 20, 22], но более разнообразен, чем у фонтиналиса, собранного в водоеме Самарской Луки [12]. Кроме того, липиды мха из Енисея отличались высокой степенью ненасыщенности ЖК как за счет большего содержания обычных ненасыщенных кислот, так и за счет ацетиленовых кислот. Вероятно, это связано с низкой температурой обитания F. antipyretica в р. Енисей. Суммарное содержание ω3-кислот достоверно увеличивалось в липидах фонтиналиса весной, а уровень ω6-кислот достоверно не изменялся (рис. 6).
Как свидетельствуют данные, полученные рядом авторов [20, 26, 27], предшественниками в синтезе ацетиленовых кислот являются соответствующие полиеновые кислоты, например, 18:3ω3 и 18:2ω6. Кроме того, эти же кислоты являются предшественниками и в синтезе длинноцепочечных полиеновых кислот. Следовательно, пути синтеза ацетиленовых и полиненасыщенных длинноцепочечных ЖК могут конкурировать за субстрат и быть в противофазе друг другу. Действительно, корреляционный анализ, проведенный между 2-й и 3-й группами, объединяющими соответственно ω3- и ω6-кислоты, и 4-й группой, представленной доминирующими ацетиленовыми кислотами С18-ряда (рис. 5), показал, что между группами ненасыщенных и ацетиленовых кислот имеется достоверная отрицательная корреляция (r = –0.61).
Следует отметить, что в группу ацетиленовых кислот не входит третья доминирующая кислота – 8a,11,14–20:3. Содержание этой кислоты отрицательно коррелировало с содержанием 6a,9,12,15–18:4 (r = –0.51), главный путь синтеза которой включает десатурацию в Δ15-положении 6a,9,12–18:3 [20, 26]. Пути синтеза С20-ацетиленовых кислот у мхов не изучены. Результаты корреляционного анализа могут свидетельствовать о том, что 8a,11,14–20:3, вероятно, синтезируется из соответствующего более короткого ацетиленового предшественника 6a,9,12–18:3 путем элонгации.
Абсолютное содержание ацетиленовых кислот в биомассе мха р. Енисей колебалось в достаточно больших пределах, но всегда оставалось на высоком уровне. Перифитонные микроводоросли, обитающие в р. Енисей, такие кислоты не синтезировали [28]. Таким образом, ацетиленовые кислоты, синтезируемые в данной экосистеме исключительно фонтиналисом, могут быть использованы как высокоспецифичные биомаркеры при изучении трофических взаимодействий высшей растительности и зообентоса на протяжении всех сезонов года.
Работа поддержана грантами Российского фонда фундаментальных исследований (№ 08-04-00286-а), Министерства образования и науки Российской Федерации, Американского фонда гражданских исследований и развития (CRDF, № REC-002) и Программы "Фундаментальные исследования и высшее образование" (№ PG07-002-1), а также грантом Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых ученых (МД – 4114.2008.4).

 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Parker J.D., Burkepile D.E., Collins D.O., Kubanek J., Hay M.E. Stream Mosses as Chemically-Defended Refugia for Freshwater Macroinvertebrates // Oikos. 2007. V. 116. P. 302-312.
2. Gladyshev M.I., Emelianova A.Y., Kalachova G.S., Zotina T.A., Gaevsky N.A., Zhilenkov M.D. Gut Content Analysis of Gammarus lacustris from a Siberian Lake Using Biochemical and Biophysical Methods // Hydrobiologia. 2000. V. 431. P. 155-163.
3. Sushchik N.N., Gladyshev M.I., Kalachova G.S., Kravchuk E.S., Dubovskaya O.P., Ivanova E.A. Particulate Fatty Acids in Two Small Siberian Reservoirs Dominated by Different Groups of Phytoplankton // Freshwater Biol. 2003. V. 48. P. 394-403.
4. Kohn G., Demmerie S., Vandekerkhove O., Hartmann E., Beutelmann P. Distribution and Chemotaxonomic Significance of Acetylenic Fatty Acids in Mosses of the Dicranales // Phytochemistry. 1987. V. 26. P. 2271-2275.
5. Zotina Т.А. The Biomass of Macrophytes at Several Sites of the Upper Reaches of the Yenisei River // J. Sib. Fed. Univ. Biology. 2008. V. 1. P. 102-108.
6. Dembitsky V.M., Rezanka T., Bychek I.A., Afonina O.M. Polar Lipid and Fatty Acid Composition of Some Bryophytes // Phytochemistry. 1993. V. 33. P. 1009-1014.
7. Dembitsky V.M., Rezanka T. Distribution of Acetylenic Acids and Polar Lipids in Some Aquatic Bryophytes // Phytochemistry. 1995. V. 40. P. 93-97.
8. Anderson B., Anderson W.H., Chipault J.R., Ellison E.C., Fenton S.W., Gellermann J.L., Hawkins J.M., Schlenk H. 9,12,15-Octadecatrien-6-ynoic Acid, New Acetylenic Acid from Mosses // Lipids. 1974. V. 9. P. 506-511.
9. Anderson W.H., Gellermann J.L. Acetylenic Acids from Mosses // Lipids. 1975. V. 10. P. 501-502.
10. Jamieson G.R., Reid E.H. Lipids of Fontinalis antipyretica // Phytochemistry. 1976. V. 15. P. 1731-1734.
11. Dembitsky V.M., Rezanka T. Distribution of Diacylglycerylhomoserines, Phospholipids and Fatty Acids in Thirteen Moss Species from Southwestern Siberia // Biochem. Syst. Ecol. 1995. V. 23. P. 71-78.
12. Dembitsky V.M., Rezanka T. Acetylenic Fatty Acids of the Dicranaceae // Phytochemistry. 1994. V. 36. P. 685-689.
13. Telang S.A., Pocklington R., Naidu A.S., Romankevich E.A., Gitelson I.I., Gladyshev M.I. Carbon and Mineral Transport in Major North American, Russian Arctic, and Siberian Rivers: The St. Lawrence, the Mackenze, the Yukon, the Arctic Alaskan Rivers, the Arctic Basin Rivers in the Soviet Union, and the Yenisei // Biogeochemistry of Major World Rivers / Eds Degens E.T., Kempe S., Richey J.E. Chichester: Wiley & Sons, 1991. P. 75-104.
14. Spitzer V. Structure Analysis of Fatty Acids by Gas Chromatography – Low Resolution Electron Impact Mass Spectrometry of Their 4,4-Dimethyloxazoline Derivatives – A Review // Prog. Lipid Res. 1997. V. 35. P. 387-408.
15. Плохинский Н.А. Алгоритмы биометрии. М.: изд-во МГУ, 1980. 150 с.
16. Christie W.W. Mass Spectra of Methyl Esters of Fatty Acids. http:// www.lipid.co.uk.
17. Spitzer V., Tomberg W., Hartmann R., Aichholz R. Analysis of the Seed Oil of Heisteria silvanii (Olacaceae). A Rich Source of a Novel C-18 Acetylenic Fatty Acid // Lipids. 1997. V. 32. P. 1189-1200.
18. Tsevegsuren N., Christie W.W., Losel D. Tanacetum (Chrysanthemum) corymbosum Seed Oil: A Rich Source of a Novel Conjugated Acetylenic Acid // Lipids. 1998. V. 33. P. 723-727.
19. El-Jaber N., Estevez-Braun A., Ravelo A.G., Munoz-Munoz O., Rodriguez-Afonso A., Murguia J.R. Acetylenic Acids from the Aerial Parts of Nanodea muscosa // J. Nat. Prod. 2003. V. 66. P. 722-724.
20. Guschina I.A., Dobson G., Harwood J.L. Lipid Metabolism in the Moss Dicranum scoparium: Effect of Light Conditions and Heavy Metals on the Accumulation of Acetylenic Triacylglycerol // Physiol. Plant. 2002. V. 116. P. 441-450.
21. Бычек И.А. Особенности распределения липидов в бриофитах: таксономический и экологический аспект // Биохимия. 1994. Т. 59. С. 1646-1662.
22. Karunen P., Liljenberg C. Temperature Induced Changes of the Ultrastructure and Lipid Composition in Green and Senescent Leaves of Dicranum elongatum // Physiol. Plant. 1981. V. 53. P. 48-54.
23. Karunen P., Hakala K., Mikola H. Combined Effect of Light and Temperature on Triacylglicerol Accumulation in Dicranum elongatum // Physiol. Plant. 1988. V. 73. P. 335-338.
24. Buck W.R., Allen B. Ordinal Placement of the Fontinalaceae // Cryptogamie: Bryologie, Lichénologie. 1997. V. 18. P. 227-234.
25. Tsydendambaev V.D., Christie W.W., Brechany E.Y., Vereshchagin A.G. Identification of Unusual Fatty Acids of Four Alpine Plant Species from the Pamirs // Phytochemistry. 2004. V. 65. P. 2695-2703.
26. Gellerman J.L., Anderson W.A., Schlenk H. Synthesis and Function of 9,12,15-Octadecotrien-6-ynoic Acid in the Moss Ceratodon purpureus // Biochemistry. 1977. V. 16. P. 1258-1262.
27. Kohn G., Hartmann E., Stymne S., Beutelmann P. Biosynthesis of Acetylenic Fatty Acids in the Moss Ceratodon purpureus (Hedw) Brid. // J. Plant Physiol. 1994. V. 144. P. 265-271.
28. Sushchik N.N., Gladyshev M.I., Kravchuk E.S., Ivanova E.A., Ageev A.A., Kalachova G.S. Seasonal Dynamics of Long-Chin Polyunsaturated Fatty Acids in Littoral Benthos in the Upper Yenisei River // Aquat. Ecol. 2007. V. 41. P. 349-365.

 
ПОДПИСИ К РИСУНКАМ.
Рис. 1. Ионная хроматограмма метиловых эфиров ЖК липидов F. antipyretica.

Рис. 2. Масс-спектры метиловых эфиров основных ацетиленовых кислот липидов F. antipyretica.
а – 6a,9,12–18:3 (А1); б – 6a,9,12,15–18:4 (А2); в – 8a,11,14–20:3 (А5). М+ – молекулярный ион.

Рис. 3. Масс-спектры диметилоксазолиновых производных двух ацетиленовых ЖК.
а – 6a,9,12–18:3 (А1); б – 8a,11,14–20:3 (А5). Точками отмечены диагностические фрагменты, молекулярный вес которых различается на 10 или 12 ам. [М – 1]+ – молекулярный ион минус одна атомная масса.

Рис . 4. Масс-спектр метилового эфира ацетиленовой кислоты 7,11а,13t–20:3 (А6).

Рис. 5 Корреляционный граф содержания ЖК (% от суммы ЖК) в F. antipyretica, собранного в верховье р. Енисей в течение 2003–2006 гг.
r – статистически достоверный коэффициент корреляции (p < 0.05).            – 0.5 ≤ r ≤ 0.6;
             – 0.6 ≤ r ≤0.7;             – 0.7 ≤ r ≤ 0.8;             – 0.8 ≤ r ≤ 0.9;              – 0.9 ≤ r ≤ 1.0.

Рис. 6. Содержание отдельных групп ЖК (% от суммы ЖК) у F. antipyretica, собранного в верховье р. Енисей, со сходной сезонной динамикой.
З – зима; В – весна; Л – лето; О – осень. I – группа насыщенных кислот; II – группа ω3-кислот; III – группа ω6-кислот; IV – группа ацетиленовых кислот; V – 7,11а,13t–20:3- и 20:3ω6-кислот; VI – суммарное содержание ЖК в сухом веществе. Штриховка – доля ацетиленовой кислоты 8а,11,14–20:3 в группе II.