УДК 581.1:591.23:595.142.39:632.937

BЛИЯНИЕ Вt-РАСТЕНИЙ НА ПОЧВЕННУЮ БИОТУ И ПЛЕЙОТРОПНЫЙ ЭФФЕКТ δ -ЭНДОТОКСИН-КОДИРУЮЩИХ ГЕНОВ

 © 2008г. А. Г. Викторов 

Институт проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова Российской академии наук, Москва

Поступила в редакцию 12.05.2008 г.

Обзор работ, на основании которых сделано заключение об экологической безопасности трансгенных растений, показал, что в ряде случаев использованные методики и тест-объекты не были адекватны поставленным задачам. Результатом широкого применения трансгенных Bt-растений может стать долгосрочное негативное воздействие на окружающую среду. Во-первых, их культивирование приводит к накоплению Bt-токсинов в почве; во-вторых, разложение трансгенных растений происходит значительно медленнее, нежели изогенных линий; в-третьих, биологическая активность почв под трансгенными растениями ниже, чем на контрольных участках. d -Эндотоксин-кодирующие гены, пересаженные в геном сельскохозяйственных культур, оказывают одновременное влияние на несколько совершенно различных признаков генетически модифицированных растений, т.е. имеют плейотропный эффект. Результатом этого возникает парадоксальная ситуация: культуры, выведенные методами генетической инженерии устойчивыми к вредителям из одного отряда насекомых (Lepidoptera), оказываются более привлекательными для вредителей из другого отряда (Homoptera).

----------------------------------

Адрес для корреспонденции

: Викторов Александр Георгиевич. 119071 Москва, Ленинский проспект, д. 33. Институт проблем экологии и эволюции РАН. Электронная почта: aleviktorov@yandex.ru

ВВЕДЕНИЕ

Bt-растениями называют генетически модифицированные растения, содержащие δ-эндотоксин-кодирующие гены грам-положительной аэробной спорообразующей бактерии Bacillus thuringiensis. δ-Эндотоксины - многочисленный класс белков, убивающих личинки насекомых разных отрядов: CryI и CryIIB токсичны для отряда Чешуекрылых (Lepidoptera); CryIIA - для Lepidoptera и Двукрылых (Diptera); CryIII – для Жескокрылых (Coleoptera); и четыре вида CryIV белков для Двукрылых (Diptera). Препараты, содержащие смесь клеток, спор и параспоральных кристаллов (локализованные рядом со спорой) δ-эндотоксинов стали пионерами биологической борьбы с вредителями сельскохозяйственных культур: первый промышленный инсектицид "Sporein", содержащий Bt-токсин, был создан во Франции в 1938 г. С тех пор этот класс инсектицидов считается одним из наиболее экологически безопасных средств защиты растений, так как он токсичен для теплокровных животных лишь в концентрациях в несколько тысяч раз превышающих дозы, используемые при обработке агроценозов.

В настоящее время промышленно выращивают около тридцати сельскохозяйственных Bt-культур. В этот список входит кукуруза (Zea mays L.), хлопчатник (Gossypium hirsutum L.), картофель (Solanum tubersoum L.), особый сорт рапса Brassica napus L. "канола" (canola – от can[ada] o[il] l[ow] a[cid] - канадское слабокислое масло), рис (Oryza sativa L.), брокколи (Brassica oleracea L. var. cymosa), арахис (Arachis hypogea L.), баклажан (Solanum melongena L.), табак (Nicotiana tabacum L.) и т.д. Большинство сортов трансгенной кукурузы содержат ген, кодирующий белок Cry1Ab и защищающий их от опасного вредителя - личинок кукурузного (стеблевого) мотылька Ostrinia nubilalis Hbn (Lepidoptera: Pyralidae). По оценке Агентства по защите окружающей среды США (US EPA), только использование Bt-зерновых культур в США приводит к ежегодному сокращению применения синтетических инсектицидов на площади примерно 3 млн. га. Это приводит к экономии инсектицидов на сумму около 2.7 млрд. долларов США [1]. Увеличивается использование Bt-культур во всем мире. В 2004 г. общая площадь их плантаций занимала 15.6 млн. га, из них около 11.2 млн. га приходилось на долю генетически модифицированной кукурузы [2]. В 2007 г. площадь посевов трансгенных культур, вырабатывающих Cry-белки, увеличилась почти в два раза: так, только в Индии и Китае плантации Bt-хлопчатника занимали в совокупности 10 млн. га [3].

Однако есть и обратная сторона медали. Все больше данных говорит о том, что использование Bt-растений не всегда эффективно против вредителей, а их выращивание может иметь долгосрочное негативное воздействие на окружающую среду, экономический ущерб которого пока даже трудно оценить [4- 6]. Во-первых, Bt-кукуруза производит в 1500- 2000 раз больше эндотоксина, нежели его распыляют при однократной обработке полей химикатами типа DIPEL, содержащими Bt-токсин. Во-вторых, разложение трансгенных растений происходит значительно медленнее, нежели генетически немодифицированных линий. И, наконец, культивирование Bt-кукурузы приводит к накоплению Bt-токсинов в почве, а биологическая активность почв под трансгенными растениями заметно ниже, чем на контрольных участках.

 

 

ТКАНЕВАЯ И ВРЕМЕННАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ СИНТЕЗА

Bt-ТОКСИНА

Широкое применение трансгенных растений со временем преподнесло их разработчикам и пользователям довольно неприятный сюрприз. Выяснилось, что ряд Bt-культур в одиночку не справляются с вредными насекомыми, против которых они были выведены. Так, например, Bt-хлопчатник (Bollgard® в США, Ingard® в Австралии, Monsanto Co., St. Louis, MO) показывает высокую эффективность против табачной огневки Heliothis virescens и хлопковой моли Pectinophora gossypiella. Однако для того, чтобы ограничивать численность хлопковых совок Spodoptera frugiperda, S. exigua, Helicoverpa zea, H. armigera и H. punctigera, во многих случаях оказалось необходимым дополнительное применение таких инсектицидов, как пиретроиды, карбаматы и даже фосфорорганическое соединения [7]. Кроме того, ряд наблюдений свидетельствовал о том, что гусеницы хлопковых совок значительно чаще встречались на семенных коробочках, нежели на прицветниках и листьях [8].

Изучению этого феномена была посвящена целая серия работ. Так, исследование содержания эндотоксина Cry1Ac в различных тканях хлопчатника (Bollgard® 531 на основе сорта Coker 312) в течение всего вегетационного сезона показало, что содержание эндотоксина в верхушечных листьях и тканях плода варьировало очень сильно. Среднее содержания эндотоксина в тканях плода падало с 57.1 мкг/г сухого веса у растения 53-дневного возраста до 6.7 мкг/г сухого веса у 116-дневного хлопчатника. В еще большей степени снижались концентрации эндотоксина в верхушечных листьях: от 163.4 до 34.5 мкг/г сухого веса соответственно. Значительные различия наблюдались в одних и тех же тканях у растений, произраставших в разных частях поля. Это говорит о том, что окружающая среда может оказывать влияние на синтез Cry1Ac или их стабильность. Тем не менее, активность Cry1Ac белков в верхушечных листьях всегда была выше, чем в тканях плода [9].

Исследования других сортов Bt-хлопчатника - GK19 (несущего Cry1Ac/Cry1Ab химерный ген) и BG1560 (несущего обычный Cry1Ac ген) - выявили еще более сложную картину варьирования интенсивности синтеза эндотоксина во времени: содержание Cry-белков находилось на высоком уровне на ранних и поздних стадиях развития хлопчатника и снижалось в середине вегетационного сезона. Однако во всех случаях содержание эндотоксина в листьях, лепестках и тычинках было существенно выше, чем в семяпочках и семенных коробочках. Интересным представляется и то обстоятельство, что синтез Cry1Ac/Cry1Ab химерного белка в линии GK19 был подвержен более высокой изменчивости в течение всего вегетационного сезона по сравнению с линией BG1560 [10].

В Индии фермеры предпочитают трансгенный хлопчатник с большой продолжительностью жизни и поздним созреванием (Bollgard-MECH-162, Bollgard-RCH-2 и Bollgard-RCH-20), так как, по сравнению с другими гибридами (Bollgard-MECH-12, Bollgard-MECH-184, Bollgard-RCH-134, Bollgard-RCH-138, Bollgard-RCH-144), они имеют большие коробочки и лучшее качество волокна. Однако именно у сортов с более высокими потребительскими качествами в более раннем возрасте снижается уровень синтеза Cry-белков, что заставляет, во избежание экономического ущерба, применять инсектициды [11].

У трансгенной кукурузы (Bt11) наиболее интенсивный синтез Cry-белков происходит в тканях листьев. В период физиологической зрелости растения концентрация Bt-токсина держалась в них на уровне 3.3 мкг/г сырого веса. Пик экспрессии бактериального гена в тканях листа приходился на 25-й день жизни кукурузы - 168 нг/мг белка. Однако со временем этот показатель снижался и уже на 84-й день составлял лишь 10.2 нг/мг белка. Уровень синтеза Cry-белков в других тканях кукурузы в период ее зрелости варьирует от 0.4 ppm в кочерыжке початка до 16.2 нг/мг в зерне, при модальном значении для большинства других тканей равном 6 нг/мг [12]. Кроме того, модифицировать экспрессию бактериального гена могут многие факторы окружающей среды, такие например, как температура и влажность, содержание азота и концентрация в атмосфере углекислого газа. Так, к уменьшению синтеза Cry-белков у Bt-хлопчатника приводит как дефицит N, так и повышение концентрации CO2 [13]. Напротив, увеличение количества вносимых N-содержащих удобрений приводит к увеличению синтеза Bt-эндотоксина на 14% [14]. Повышение температуры окружающей среды до 37оС приводит к существенному снижению содержания Cry1Ac белков в растениях хлопчатника на стадии семенных коробочек [15]. Существенно снижает уровень синтеза Bt-эндотоксина как дефицит, так и избыток Н2О, однако степень этого снижения зависит от уровня влажности и конкретного органа растения [16]. Очевидно, что синтез Cry-белков тесно связан с метаболизмом азота, а на содержание Bt-эндотоксина могут также сильно влиять процессы деградации и ремобилизации. Тем не менее, далеко не все факторы окружающей среды приводят к уменьшению содержания Bt-эндотоксина в тканях трансгенных растений. Так, например, засоление почв до 100 мМ NaCl не приводит к значимым изменениям в содержании Cry-белков в Bt-хлопчатнике при сравнении опытного и контрольного вариантов [17].

Падение уровня Bt-эндотоксина не всегда означает потерю инсектицидных свойств трансгенного растения. Очевидно, что для каждого вредителя есть свой пороговый уровень концентрации Cry-белков в тканях растения. Однако пока он определен лишь в единичных случаях. Так, для хлопковой совки H. armigera данный показатель равен 1.8 мкг/г сырого веса растения. При концентрации Bt-эндотоксина ниже этого уровня выживаемость гусениц на трансгенном хлопчатнике существенно повышалась. Необходимо отметить также, что чувствительность различных вредителей к Cry1Ac белкам неодинакова. Так, хлопковые совки рода Helicoverpa (основные вредители хлопчатника в Аргентине, Индии и Китае) почти в 10 раз более устойчивы к ним, по сравнению с табачной огневкой Heliothis virescens, основным вредителем хлопчатника в США. В то время, как гусеницы совок питаются репродуктивными тканями, огневки предпочитают листья. Разная чувствительность этих насекомых к эндотоксину и разный уровень концентрации последнего в тканях растения и приводит к тому, что в США "инсектицидный" Bt-хлопчатник имеет 99- 100% эффективность, в то время, как в странах третьего мира он еще далек от этого [11].

Наблюдаемая картина временнóй и тканевой специфичности количества производимого трансгенным растением Cry-белков, усугубляемая видоспецифичной чувствительностью вредителей к Bt-эндотоксину во многом усложняет как оценку экологических рисков, так и эффективность использования Bt-растений в сельскохозяйственном производстве [18].

 

ПОСТУПЛЕНИЕ  Bt-ТОКСИНОВ В ПОЧВУ

После сбора урожая на одном гектаре кукурузного поля остается без малого 10 т растительных остатков (2.0–2.5 т силоса и около 6 т зерна). В случае трансгенной культуры данные цифры означают, что около 10% Bt-токсинов, содержавшихся в живых растениях, попадают как непосредственно в почву, так и на ее поверхность. От локализации растительных остатков в почвенном профиле в значительной степени зависит скорость распада содержащегося в них Bt-токсина. Это было убедительно показано в исследованиях, проведенных в Швейцарии с генетически модифицированной линией SyngentaN4640 Bt (Bt11). Так, в эксперименте, моделирующем обработку почвы плугом, концентрация токсина Cry1Ab в растительных остатках (15.4 ± 4.3 мкг/г сухого веса), попавших в середине октября 1999 г. в почву на глубину от 0 до 20 см, сокращалась через 60 дней (декабрь 1999 г.) до 20% от начальной концентрации и оставалась примерно на этом же уровне (около 3 мкг/г сухого веса) в течение зимних месяцев. Лишь с началом весны возобновлялась дальнейшая деградация Bt-токсина, однако и в середине мая 2000 г. он продолжал присутствовать в растительных остатках на уровне 1.5% от начального количества. В июне 2000 г. Bt-токсин еще можно было обнаружить в почве, но его точную концентрацию определить было невозможно. Во второй серии экспериментов, проходивших в следующем сезоне, растительные остатки не смешивались с почвой искусственно, а переносились в ее глубь с поверхности дождевыми червями Lumbricus terrestris. В первые 40 дней эксперимента концентрация Bt-токсина снизилась с 15.5 ± 12.9 мкг/г (начало декабря 2000 г.) до 5.9 ± 4.7 мкг/г (середина января 2001 г.), т.е. до 38% от его начального количества. Через 80 дней после начала эксперимента (конец февраля 2001 г.) концентрация токсина снизилась до 2.2 ± 1.3 мкг/г, через 120 дней (начало апреля 2001 г.) - до 1.1 ± 0.7 мкг/г. В конце продолжавшегося 200 дней эксперимента (конец июня 2001 г.) в растительных остатках сохранилось лишь 0.05 ± 0.04 мкг/г Bt-токсина. Различия в скорости разложения Bt-токсина между двумя опытами связано со следующими обстоятельствами. Во-первых, дождевые черви, откладывая свои экскременты (богатые микрофлорой) на поверхности почвы, способствуют, тем самым, более быстрой колонизации растительных остатков микроорганизмами и, соответственно, их более быстрому разложению, что и нивелирует в известной степени действие низких зимних температур. Во-вторых, действие солнечного света также способствует инактивации Cry-белков. Из этого авторы сделали вывод, что в агроценозах, не использующих обработку почв плугом, происходит более быстрое начальное разложение Bt-токсина. Но в любом случае деградация Cry-белков по своей сути является функцией разложения содержащих их растительных остатков [19].

Эти результаты принципиально отличаются от проведенных ранее лабораторных исследований, в которых было показано, что 50% Bt-токсинов разлагалось в течение 1.5 дней после попадания в почву и 90% - в течение 15 дней. В случае, если растительные остатки не контактировали с почвой, то 50% распад Cry-белков происходил в течение 25.6 дней, а 90% - в течение 40.7 дней [20]. Столь сильные различия в скорости разложения Bt-токсинов, очевидно, связаны с тем, что в лабораторных условиях эксперименты проводились при постоянной комнатной температуре, в то время как в природе кроме холодного зимнего периода, характерного для средней полосы, где и произрастает основная масса трансгенной кукурузы, происходят и суточные колебания температуры. Кроме того, в лабораторных экспериментах листья кукурузы перемалывали, просеивали и лиофилизировали, что обеспечивало существенно бóльшую площадь для колонизации микроорганизмами. Естественно, что листья кукурузы, в лабораторных экспериментах попадавшие в почву в виде муки, в естественных условиях в нее никогда не поступают. Этот пример говорит о том, что необходимо подходить с крайней осторожностью к экстраполяции результатов лабораторных опытов с Bt-токсинами на естественные условия. Ведь оказалось, что максимальный срок, в течение которого Cry-белки, попавшие в почву в результате выделений корней и разложения растительных остатков, сохраняли свои инсектицидные свойства в течение 350 дней [21]. Bt-токсины сохраняли свою биологическую активность в почве в течение столь длительного времени (фактически до года) благодаря тому, что они связывались поверхностно активными почвенными частицами (глины, гумуса и т.д.), что защищало их от разложения микроорганизмами. Более того, инсектицидная активность Cry-белков, адсорбированных почвенными частицами, не только сохранялась, но в ряде случаев даже повышалась [22]. Параллельные исследования влияния Bt-кукурузы на обитателей почв кукурузных полей Дании и Франции показали, что значительное сокращение численности микроартропод происходит лишь в почвах с высоким содержанием глины (27.9 и 43.1% соответственно). На этих двух полях произрастали трансгенные сорта кукурузы MEB307 (MON810) и DK532BT соответственно [23].

Конечно, поступление в почву Cry-белков в результате выделений корней трансгенных растений не столь велико, как в результате разложения растительных остатков, оставшихся на полях после сбора урожая, но этот фактор также нельзя сбрасывать со счетов. Интересно отметить, что если корневые отростки канолы, табака и хлопчатника вообще не выделяют Bt-токсинов [1], то все 12 исследованных трансгенных сортов кукурузы, полученных в результате трех независимых друг от друга генно-инженерных операций (Bt11, MON810, и 176), продуцируют Cry-белки практически в одинаковых объемах [21]. Причем, как было показано на трансгенной кукурузе MON810, концентрация Cry1Ab белков в корневых выделениях не зависит от возраста растения [24]. Кроме того, было обнаружено, что ларвицидная активность выделений корней кукурузы была самой большой - достоверно более высокой, нежели у риса и картофеля. Хотя некоторая доля Cry-белков может попасть в почву и в результате шелушения или механического повреждения корней, основная часть Bt-токсинов поступает в почву именно с выделениями корней. Об этом свидетельствуют исследования выращиваемых в гидропонной культуре растений Bt-кукурузы, Bt-риса и Bt-картофеля. Никаких нарушений корневой поверхности у них быть не могло, а Cry-белки в питательном растворе все равно присутствовали [21].

 

CКОРОСТЬ РАЗЛОЖЕНИЯ РАСТИТЕЛЬНЫХ ОСТАТКОВ Bt-РАСТЕНИЙ и СОДЕРЖАНИЕ

В НИХ ЛИГНИНА

Ключевую роль в разложении растительных остатков играют почвенные беспозвоночные: именно благодаря им происходит первичное разрушение растительных остатков, что обеспечивает поле деятельности для микроорганизмов.

Как оказалось, Bt-растения не привлекательны даже для тех фитофагов и сапрофагов, которые не чувствительны к Cry-белкам. В частности, это было показано в исследованиях пищевой преференции лабораторных популяций погребной, или шероховатой мокрицы Porcellio scaber Latreille (Isopoda, Oniscidea). В течение 20 дней в качестве корма этим сухопутным ракообразным предлагали растения двух трансгенных сорта кукурузы фирмы Syngenta - Max88 (176) и N4640Bt (Bt11), и шести контрольных линий - N4640, Magister, Banguy, LG2265, LG2275 и Attribut. Линия N4640 была изогенной линией Syngenta N4640Bt. Опыты показали, что мокрицы явно избегают употреблять Bt-кукурузу линии N4640Bt. Вторая трансгенная линия Max88 содержала значительно меньше Cry1Ab белка, и различий в ее потреблении мокрицами по сравнению изогенными линиями отмечено не было [25]. Авторы связали различие в пищевой преференции с тем, что линия N4640Bt содержала значительно больше Cry1Ab токсина (19.7 ± 6.6 мкг/г сухого веса), чем Max88 (2.9 ± 1.9 мкг/г сухого веса). В течение эксперимента, продолжавшегося 20 дней, концентрация токсина в первой линии траснсгенной кукурузы снизилась на 21% (до 15.5 ± 7.9 мкг/г сухого веса), а во второй - на 62% (до 1.1 ± 0.7 мкг/г сухого веса). Однако эти различия были значимы только в последнем случае. Никакой достоверной корреляции между уровнем потребления и содержанием азота или калорийностью различных линий кукурузы обнаружено не было.

Опыты, проведенные с рядом видов ногохвосток (Heteromurus nitidus, Folsomia candida и Sinella coeca), показали, что если первый вид достоверно избегает листьев трансгенной кукурузы DK-440 BTY "YieldGard" (MON810), то два других не отдают явного предпочтения изогенной линии перед трансгенной. Тем не менее, F. candida, питаясь Bt-кукурузой, производит значительно меньше фекалий, нежели в контроле. Очевидно, с тем, что для этого вида коллембол трансгенная кукуруза представляет собой не столь удобоваримую пищу, связана их пониженная плодовитость при питании растениями аналогичной линии Bt-кукурузы (MON810) [26].

Полевые исследования, проходившие в Швейцарии, показали, что растительные остатки Bt-кукурузы Syngenta N4640Bt (Bt11) заселяли в 1.2 раза меньше гамазовых клещей, в 1.3 раза меньше олигохет-энхитреид и в 1.5 раза меньше коллембол из сем. Tullbergiidae, нежели растительные остатки изогенной линии [27]. Авторы связали наблюдаемую картину с высокой концентрацией Cry1Ab белка (от 0.9 до 3.0 мкг/г) в начале эксперимента (середина ноября), поскольку в его завершающей стадии (середина июня) численность этих таксонов в опыте и эксперименте статистически не различалась.

К сожалению, во всех перечисленных выше работах не исследовали связь между пищевой привлекательностью растительных остатков и содержанием в них лигнина.

Лигнин - высокомолекулярное соединение ароматической природы - основной структурный компонент растений, заполняющий пространство между клетками и соединяющий их первичные оболочки. Именно лигнин обеспечивает прочность и жесткость растительных конструкций, а также их водонепроницаемость. С одной стороны, повышенное содержание лигнина затрудняет "работу" фитофагов, с другой стороны, замедляет процессы разложения растительных остатков в почве. При разложении лигнина в окружающую среду выделяются токсичные низкомолекулярные продукты распада (фенолы, метанол, карбоновые кислоты).

Содержание лигнина в стеблях различных линиях Bt-кукурузы (Bt11, MON810 и 76) варьировало в пределах 5.9–7.9%, в то время как в изогенных им линиях (N7590, N67-H6, N3030, NC4880, NK4640, P3223, DK647, DK679, DK626) этот показатель не превышал 4.8–5.2%. Более высокое содержание лигнина выявлялось и на морфологическом уровне. Исследование поперечных срезов стеблей методом флуоресцентной микроскопии (окраска толуидиновым синим) показало, что сосудистые пучки и окружающие их клетки склеренхимы, содержащие лигнин, были у Bt-растений почти в два раза толще, нежели у изогенных линий (21.50 ± 0.84 мкм и 12.40 ± 1.14 мкм соответственно). Анализ аналогичных препаратов, но уже окрашенных ацетил бромидом, выявил, что в Bt-кукурузе содержание лигнина на 33–97% выше, чем в нетрансгенных растениях. Представляется важным еще одно любопытное обстоятельство: содержание лигнина в кукурузе, растущей в естественных условиях, было выше, нежели в растениях, выращиваемых в лабораторных условиях. Это говорит о том, что далеко не всегда трансгенное растение ведет себя в лабораторных условиях так же, как в естественных. Кроме того, оказалось, что содержание лигнина достоверно различалось в трех основных линиях трансгенной кукурузы, полученных в результате различных операций по генетической модификации. Так, линия Bt11 в поле и в лаборатории содержала значительно больше лигнина (7.40 ± 0.10% и 6.70 ± 0.12% соответственно), нежели MON810 (6.90 ±0.07% и 6.20 ± 0.10% соответственно). Содержание лигнина в Bt-линии 176 было достоверно меньше, чем в первых двух линиях [28].

Изучение закономерностей распределения лигнина по различным тканям кукурузы выявило, что повышенное содержание лигнина характерно лишь для стеблей Bt-кукурузы американского сорта Novelis (MON-00810-6; Monsanto) и швейцарского сорта Valmont (SYN-EV176-9, Syngenta), в то время, как ее листья содержали примерно такое же количество лигнина, что и генетически немодифицированные растения (соответствующие изогенные сорта Nobilis и Prelude). Подобное различие, видимо, связано с тем, что в стеблях, по сравнению с листьями, синтез лигнина происходит более интенсивно, так как именно это вещество обеспечивает их упругость. Как известно, лигнин как гетерополимер состоит из гидроксифенильных (P), гваяцильных (G) и сирингильных (S) субъединиц. Оказалось, что к повышенному содержанию лигнина в Bt-линиях кукурузы приводит увеличение количества P18 (транс-3-(4-метоксифенил)-3-пропеноевая кислота) и G18 (транс-3-(3,4-диметоксифенил)-3-пропеноевая кислота) блоков. G-тип субъединиц химически более устойчив (в том числе, к окислению и деметилированию), нежели S-тип, и потому более высокое соотношение G/S-блоков в стеблях трансгенных линий кукурузы вносит дополнительную лепту в ее пониженную пищевую ценность. Последнюю, главным образом, определяет не соотношение субъединиц, а общее содержание лигнина [29].

Исследование различных Bt-модифицированных линий риса, табака, хлопчатника и картофеля показало, что существенно более высокое содержание лигнина (на 10–66%) свойственно всем трансгенным растениям, что отличает их от соответствующих изогенных линий [30].

 

Bt-ТОКСИНЫ И ДОЖДЕВЫЕ ЧЕРВИ

Одним из основных биологических агентов, обеспечивающих утилизацию растительного опада в средней полосе, служат дождевые черви (Oligochaeta; Lumbricidae). Эти почвенные беспозвоночные обитают практически во всех естественных и антропогенных экосистемах умеренного пояса и доминируют в них по биомассе. Объем переносимой этими животными почвы варьирует от 2 до 250 т/га в год (что приблизительно равно слою земли толщиной от 0.1 до 5 см). Вертикальное распределение дождевых червей вдоль почвенного профиля зависит, как от их видоспецифичных преференций, так и от комплекса абиотических факторов (температуры, влажности почвы, вертикального градиента распределения органических веществ и т.д.) [31].

В силу особенностей своего развития, черви тесно связаны с химическим составом почвы, реактивно отвечая на его изменения и попадание в среду обитания различных загрязняющих агентов. Поэтому люмбрициды служат хорошими индикаторами физических и химических особенностей почвы. Роль дождевых червей в биомониторинге обусловлена тем, что они, биоаккумулируя и биоконцентрируя многие химические вещества, могут быть использованы для оценки уровня загрязнения почв хлорорганическими инсектицидами [32], тяжелыми металлами [33], радиоактивными элементами [34], флуоридами [35], полихлорированными бифенилами (ПХБ) [36], долго живущей органикой [37], кислотными выпадениями [38]. Все перечисленные выше группы поллютантов вызывают у люмбрицид как острые, так и хронические токсикозы, причем эти состояния у дождевых червей могут вызывать не только долгоживущие, но и быстро разлагающиеся соединения [39].

Разные виды и стадии развития люмбрицид могут быть подвергнуты действию токсикантов разными путями. Ювенильные формы не способны уходить глубоко внутрь почвы, поэтому они подвержены воздействию поллютантов в большей степени, нежели половозрелые особи. Однако и наиболее крупный представитель любмбрикофауны средней полосы L. terrestris, как это ни странно, также находится в "группе риска". Дело в том, что особи этого вида, скрываясь днем в глубоких норах, достигающих в глубину 3 м, каждую ночь выходят на поверхность почвы за пропитанием - растительным опадом (в России за такой образ жизни эта космополитически распространенная олигохета получила народное название "большой выползок"). Справедливости ради следует отметить, что небольшую часть их диеты составляют и корни растений. Максимальные дистанции, которые могут проходить отдельные особи во время таких путешествий, достигают 19 м (длина следов, оставляемых на поверхности почвы, варьирует от 3.8 до 19.3 м, при среднем значении - 9 м). Было показано, что в разных экосистемах за несколько осенних месяцев эти дождевые черви способны унести в свои норы практически весь растительный опад [31]. Именно эти особенности экологии L. terrestris и определяют высокий уровень их контакта как с поллютантами, наносимыми на поля, так и с трансгенными растениями. Выше уже говорилось о вкладе этого вида в более быстрое разложение растительных остатков Bt-кукурузы [19].

Развитие люмбрицид протекает в толще почвы, и в отличие от обитателей почвенных скважин или микрополостей и почвенной влаги, они связаны с ее химическим составом, реактивно отвечая на его изменения и попадание в среду обитания загрязняющих агентов, которые способны проникать в их организм через покровы. Благодаря особенностям своего питания, связанного с заглатыванием частиц почвы, в случае содержания в них токсикантов, они подвергаются их воздействию как изнутри, так и снаружи. Дождевые черви обладают низкой миграционной активностью (не более 10 м в год), в связи с чем, возможность быстрого восстановления угнетенной в результате воздействия поллютанта популяции за счет миграции извне или быстрого размножения ограничена и не может приниматься во внимание. Известным исключением могут быть лишь партеногенетические расы. Так, 6n апомиктическая Dendrobaena octaedra (Savigny), обитающая в 30-километровой зоне отчуждения Чернобыльской АЭС, единственная среди всех почвенных беспозвоночных, за два года, прошедших после аварии, не только восстановила, но даже превысила свою численность по сравнению с контролем. Это неожиданное явление связано с тем, что популяциям этих олигохет удалось выйти из-под пресса амфимиктических хищников, популяции которых восстанавливались несравнимо медленнее, так как встреча особей двух полов при многократном снижении численности стала весьма проблематичной [34, 40]. Однако партеногенетические дождевые черви в агроценозах, как правило, не обитают.

Как ни странно, обстоятельных исследований токсичности Cry-белков для дождевых червей, играющих одну из ключевых ролей в процессах разложения растительных остатков и почвообразования, до сих пор не проводилось. В начале 60-х годов было показано, что при очень больших концентрациях препарата Thuricide® (Bioferm Corporation), содержащего B. thuringiensis var. kurstaki (в 10 000 раз превышающих рекомендуемые для обработки полей дозы) в течение двух месяцев происходила 100% смертность лабораторных популяций L. terrestris [41]. На первый взгляд, эти данные имеют чисто познавательное значение, однако не следует забывать, что примененные дозы, ставшие смертельными, лишь в пять- десять раз превышали концентрацию Bt-токсинов в живых трансгенных растениях. Гистологические исследования погибших люмбрицид показали, что бактерии проникли практически во все ткани дождевых червей, где произошла их споруляция и формирование кристаллов. Позднее столь необычная патология была объяснена тем, что в опытах использовалась диатомовая земля, которая, повреждая эпителий кишечника, способствовала проникновению бактерий в дождевых червей.

Десятинедельная экспозиция лабораторных популяций D. octaedra к дозам Bt-токсин содержащих пестицидов, в тысячу раз превышавших полевые и примерно равные концентрации токсинов в живых растениях, приводила к существенному угнетению роста и размножения, а также более высокой смертности люмбрицид [42]. Вызывает, однако, удивление использование в этих опытах именно этого вида, обитающего обычно в лесной подстилке, и, как уже отмечалось выше, в естественных условиях не сталкивающегося с трансгенными культурами.

Одним из первых экотоксикологических опытов по изучению влияния трансгенных растений на дождевых червей был стандартный лабораторный тест с использованием искусственной почвы и навозного червя Eisenia fetida (Savigny). Тест показал, что экстракты листьев трансгенной кукурузы, содержавших Bt-токсин, не оказывали никакого влияния на выживание и развитие люмбрицид. Все E. fetida дожили до конца 14-дневного эксперимента, и не теряли в весе по сравнению с контрольными особями. Концентрация Bt-токсина (0.35 мг CryIA(b)/кг почвы), использованная в этом опыте, была максимальной концентрацией, которую люмбрициды могли бы встретить в естественных условиях. По расчетам авторов, она была примерно в 785 выше той концентрации, которую CryIA(b) белки имели бы в почве после уборки урожая [43]. Однако, как и в предыдущем случае, выбор вида дождевого червя не адекватен поставленным целям. В отличие от собственно почвенных видов, E. fetida не заглатывает почвенные частицы, а использует в пищу разлагающуюся органику, поэтому непонятно, какое количество Bt-токсинов попало в его пищеварительную систему и попало ли вообще. Кроме того, как и D. octaedra, E. fetida в естественных условиях не сталкивается с трансгенными культурами.

Сорокадневные наблюдения за лабораторными популяциями L. terrestris, жившими в почве, в которой прорастали семена трансгенной кукурузы или добавлялись ее листья, не выявили значимых изменений в весе и смертности дождевых червей, по сравнению с контролем, хотя и показали присутствие Bt-токсинов в их кишечниках и кастах (экскрементах). Когда червей переносили в чистую почву, в течение 1- 2 дней их кишечники освобождались от токсина [44]. К сожалению, в этой работе не оценивали влияние Bt-токсинов как на размножение люмбрицид, так и на ювенильные формы (по всем законам токсикологии они должны быть более чувствительны к токсинам). Кроме того, для такого крупного и живущего не один год (до 7 лет) дождевого червя-норника, как L. terrestris, 40-дневный срок явно недостаточен для выявления сублетальных эффектов. Проведенный несколько позднее уже двухсотдневный лабораторный эксперимент показал, что L. terrestris, потреблявшие листья трансгенной кукурузы фирмы Syngenta N4640Bt (Bt11), теряли в весе 18%, в то время как у контрольной группы был отмечен 4% привес [45]. Однако большой выползок предпочитает заселять участки, не подверженные пахоте, и потому также не совсем репрезентативен для экотоксикологической оценки влияния Bt-кукурузы. В пахотных почвах доминирует собственно-почвенный вид Aporrectodea caliginosa (Savigny), имеющий космополитическое распространение и прозванный в России "пашенным червем". Исследования, проведенные в Дании, не выявили практически никаких негативных последствий от внесения в почву тонко перемолотых листьев Bt-кукурузы (MEB307 линия) для лабораторных популяций этого вида [46]. Однако возникает вопрос к протоколу эксперимента: насколько измельчение листьев электрическим миксером в лабораторных экспериментах адекватно естественному процессу попадания Bt-токсина в почву агроценозов? Единственным значимым воздействием трансгенных растительных остатков на A. caliginosa оказалась повышенная эмбриональная смертность: на 20% (с 95% до 75%) снизилось число коконов? из которых выходили ювенильные особи. Обычно это происходит при неблагоприятных значениях ключевых абиотических факторов, таких как температура и влажность. Поскольку в данном случае и контрольный вариант, и эксперимент находились в одинаковых условиях, причины следует искать в непосредственном влиянии Bt-токсина на ранние стадии онтогенеза пашенных червей.

К сожалению, пока еще не исследовали миграцию Bt-токсинов в трофических цепях, в которые входят дождевые черви, служащие кормовой базой для многих хищных беспозвоночных, птиц и млекопитающих. К примеру, в Англии L. terrestris удовлетворяют в среднем до 10- 15% энергетических потребностей рыжих лис, а на участках, где этих олигохет особенно много, данный показатель достигает 60%. Не брезгует большими выползками и обыкновенная неясыть. Уровень поимки L. terrestris этой ночной хищницей достигает 0.39 червя в минуту, а особая любовь европейского барсука к L. terrestris породила более 20 лет назад даже гипотезу о том, что эти животные являются специализированными хищниками дождевых червей. Гипотеза эта была, в конце концов, отвергнута, однако если говорить о технике захвата пищи барсуками, то определенная специализация отмечена лишь при захвате люмбрицид [47].

ПЛЕЙОТРОПНЫЙ ЭФФЕКТ d -ЭНДОТОКСИН-КОДИРУЮЩИХ ГЕНОВ

Как уже говорилось выше, десятилетнее использование трансгенных растений в промышленных масштабах выявило у них ряд непредвиденных свойств. Отмеченными выше более высоким содержанием лигнина и корневыми выделениями Bt-токсина дело не ограничилось. Так, одним из самых неожиданных свойств Bt-растений оказалась их большая, по сравнению с нетрансгенными сортами, привлекательность для тлей. Причем, популяции тлей подчас развивались значительно быстрее на генетически модифицированных растениях, например, на Bt-хлопчатнике [48] и Bt-кукурузе [49], чем на обычных.

В ряде исследований было установлено, что численность сосущих растительноядных членистоногих на полях, засеянных Bt-хлопчатником, была больше, чем на обычных полях [50- 52]. Тли, как известно, не относятся к фитофагам, против которых были выведены Bt-культуры. Даже заселяя трансгенные растения, они не входят в контакт с Bt-токсином, так как Cry-белок не поступает во флоэму, из которой эти насекомые высасывают питательные вещества.

Исследования, проведенные в Испании, не выявили различий в видовом составе тлей, живущих на Bt-кукурузе сорта Compa CB (Compa CB1, Syngenta Seeds, Basel, Switzerland) и на изогенной генетически немодифицированной линии (Dracma®, Syngenta Seeds). Сорт Compa CB в 2003 г. был самым распространенным трансгенным сортом кукурузы в Испании: общая площадь его посевов составляла около 25 тыс. га. Экспрессия Cry1Ab белка происходит у этих растений в зеленых тканях и пыльце, причем, данная разновидность токсина опасна только для чешуекрылых: (Ostrinia nubilalis (Crambidae), Sesamia nonagrioides (Noctuidae), Pseudaletia unipuncta (Noctuidae), но не токсична для фитофагов из других отрядов. Видовой состав тлей на генетически модифицированных и обычных растениях был одинаков, однако совершенно неожиданным оказалась повышенная привлекательность трансгенной кукурузы для некоторых стадий развития тлей, что приводило к достоверному увеличению численности соответствующих возрастов на Bt-растениях. Это явление было наиболее выражено у черемуховой тли (Rhopalosiphum padi). У этого вида, служащего кормовой базой для многих специализированных и неспециализированных хищных членистоногих, плотность алят, бескрылых имаго и молодых нимф была выше именно на трансгенных сортах [53]. После колонизации тлями кукурузы существенных различий в количестве R. padi на трансгенных и генетически немодифицированных растениях не наблюдалось. Это говорит о том, что большее количество алят, заселявших кукурузу, и определяет дальнейшее различие в плотности популяций на протяжении всего сезона, поскольку трансгенные растения никак не влияют на численность тлей после колонизации [49].

Причины более высокой привлекательности трансгенной кукурузы для тлей не совсем понятны, но очевидно, что это связано с неизвестными пока процессами взаимодействия микробного гена, кодирующего Bt-токсин, с геномом растения, в который он искусственно перенесен. Предварительно можно очертить круг признаков растения, изменения которых могут иметь значения для тлей, ищущих пищу.

Во взаимоотношениях растение–насекомое химические вещества, испускаемые растениями, играют ключевую роль в поиске хозяина как фитофагами, так и паразитическими насекомыми, регулирующими их численность. Более того, ключом к запуску поведенческих механизмов, приводящих к яйцекладке, зачастую также служат химические вещества, связанные с растением-хозяином. Изменение как состава, так и объема летучих веществ, выделяемых растениями (или того и другого), может приводить к изменению поискового поведения насекомых и, таким образом, влиять на разнообразие фитофагов и их естественных врагов в агроценозе.

Исследование летучих соединений, выделяемых Bt-хлопчатником GK-97 и обычным Simian № 3, показало, что если обычный сорт испускает 16 соединений, то трансгенный - 18 [54]. Значение этих различий еще предстоит изучить. Наряду с этим, у трансгенного хлопчатника обнаружен ряд других биохимических изменений: у Bt-растений повышена активность пероксидазы, но в них значительно меньше содержится конденсированных танинов, которые обеспечивают устойчивость хлопчатника к клещам и тлям [55, 56]. Таким образом, мы видим, что ценой повышения устойчивости Bt-кукурузы к хлопковой совке служит понижение ее устойчивости к сосущим фитофагам.

Наряду с запахами, немаловажную роль в пищевом поведении насекомых играют цветовые характеристики кормовых растений. Как оказалось, сорта Bt-кукурузы имеют более насыщенный зеленый цвет, нежели изогенные сорта, и это проявлялось уже на стадии всходов. Кроме того, были отмечены некоторые различия в скорости развития трансгенной и обычной кукурузы [49]. Содержание азота в Bt-кукурузе также несколько выше, чем в изогенных линиях, что, безусловно, улучшает ее питательные свойства [57]. По всей видимости, именно с этим связано то обстоятельство, что потомство самок-алят быстрее достигает половой зрелости и имеет более высокий потенциал роста на Bt-кукурузе.

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

 

Пониженная скорость разложения трансгенных растительных остатков требует дальнейшего и всестороннего исследования, поскольку потенциальный ущерб от этого имманентного свойства Bt-культур может иметь далеко идущие экологические последствия. Еще более пристального внимания требуют особенности миграции Cry-белков по пищевым цепям [58].

Обнаружение Bt-токсинов в корневых выделениях кукурузы, риса и хлопчатника и их длительное сохранение в почве говорит и о том, что перед тем, как растения и животные, генетически модифицированные с целью производства лекарственных субстанций (антибиотиков, вакцин, гормонов, ферментов) и прочих биологически активных веществ, будут покидать стены лабораторий и оказываться в менее контролируемых условиях промышленного производства, должны быть приняты особые меры предосторожности. В отличие от Bt-растений мишенями этих соединений являются не насекомые, а люди и млекопитающие. Поскольку практически все эти вещества являются ксенобиотиками, их способность сохраняться в окружающей среде достаточно не исследована, а потому потенциальный ущерб, наносимый окружающей среде при выращивании в полевых условиях синтезирующих эти вещества трансгенных растений, даже приблизительно оценить невозможно.

Анализ десятилетнего использования трансгенных растений в промышленных масштабах со всей убедительностью показывает, что d -эндотоксин-кодирующие гены положительной спорообразующей бактерии B. thuringiensis, пересаженные в геном сельскохозяйственных культур, оказывают одновременное влияние на несколько совершенно различных признаков генетически модифицированных растений. В классической генетике подобное явление носит название интерференционной, или истинной плейотропии. В данном случае оно требует специального очень пристального изучения, поскольку получается довольно парадоксальная ситуация: культуры, выведенные методами генетической инженерии устойчивыми к вредителям из одного отряда насекомых (Lepidoptera), оказываются более привлекательными для вредителей из другого отряда (Homoptera). В результате сейчас тли стали основными вредителями Bt-хлопчатника в Китае, где засеянные им площади достигли в 2007 г. 3.8 млн. га, или 66% всех посевов этой культуры [3].

До недавнего времени победоносному шествию генетически модифицированных сельскохозяйственных культур противостояли лишь осторожные предупреждения экологов об их возможном негативном воздействии на окружающую среду и здоровье человека. Сторонники трансгенных растений эти доводы отвергали, апеллируя к тому, что и лабораторные тесты и опыт выращивания генетически модифицированных сельскохозяйственных культур в естественных условиях показали их полную экологическую безопасность. Лишь сейчас, спустя десятилетие после начала промышленного выращивания трансгенных растений, становится более или менее ясно, какого рода ущерб может быть нанесен окружающей среде, в частности, при промышленном выращивании широко распространенного типа генетически модифицированных растений - Bt-культур. Кроме того, оказалось, что использованные в ряде лабораторных экспериментов методики и тест-объекты, по результатам которых делалось заключение об экологической безопасности трансгенных растений, не всегда были адекватны поставленным задачам. И, наконец, сейчас накопилось довольно много данных, говорящих о том, что популяции вредителей сельского хозяйства выработали устойчивость к Bt-токсинам и уже начинают питаться трансгенными растениями.

 

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

  1. Saxena D., Stotzky G. Release of Larvicidal Cry Proteins in Root Exudates of Transgenic Bt Plants // ISB News Rep. February 2005. P. 1–3.
  2. James C. Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops: 2004 // ISAA. № 32. 2004. 12 p.
  3. James C. Executive summary. Brief 37. Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops: 2007 http: //www.isaaa.org/resources/publications/briefs/37/executivesummary/pdf.
  4. Кузнецов Вл.В., Куликов А.М. Генетически модифицированные организмы и полученные из них продукты: реальные и потенциальные риски // Журн. Рос. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева. 2005. Т. 49. С. 70–83.
  5. Викторов А.Г. Bt-растения и биологическая активность почв // Агрохимия. 2007. № 2. C. 83–88.
  6. Icoz I., Stotzky G. Fate and Effects of Insect Resistant Bt-Crops in Soil Ecosystems // Soil Biol. Biochem. 2008. V. 40. P. 559–586.
  7. Adamczyk J.J., Sumerford D.V. Potential Factors Impacting Season-Long Expression of Cry1Ac in 13 Commercial Varieties of Bollgard Cotton // J. Insect Sci. 2001. V. 1. P. 1–13.
  8. Adamczyk J.J., Jr, Hardee D.D., Adams L.C., Sumerford D.V. Correlating Differences in Larval Survival and Development of Bollworms (Lepidoptera: Gelechiidae) and Fall Armyworms (Lepidoptera: Noctuidae) to Differential Expression of Cry1Ac(c) δ-Endotoxin in Various Plant Parts among Commercial Cultivars of Transgenic Bacillus thuringiensis Cotton // J. Econ. Entomol. 2001. V. 94. P. 284–290.
  9. Greenplate J.T. Quantification of Bacillus thuringiensis Insect Control Protein Cry1Ac over Time in Bollgard Cotton Fruit and Terminals // J. Econ. Entomol. 1999. V. 92. P. 1377–1383.
  10. Wan P., Zhang Y., Wu K., Huang M. Seasonal Expression Profiles of Insecticidal Protein and Control Efficacy against Helicoverpa armigera for Bt Cotton in the Yangtze River Valley of China // J. Econ. Entomol. 2005. V. 98. P. 195–201.
  11. Kranthi K.R., Naidu S., Dhawad C.S., Tatwawadi A., Mate K., Patil E., Bharose A.A., Behere G.T., Wadaskar R.M., Kranthi S. Temporal and Intra-Plant Variability of Cry1Ac Expression in Bt-Cotton and Its Influence on the Survival of the Cotton Bollworm, Helicoverpa armigera (Hubner) (Noctuidae: Lepidoptera) // Curr. Sci. 2005. V. 89. P. 291–299.
  12. US Environmental Protection Agency (EPA). Bacillus thuringiensis Plant-Pesticides. Biopesticides Registration Action Document-Insect Resistance Management. Environmental Protection Agency, Washington, DC. 2000. http://www.epa.gov/oscpmont/sap/2000/october/brad4_irm.pdf. 258 p.
  13. Coviella C.E., Stipanovic R.D., Trumble J.T. Plant Allocation to Defensive Compounds: Interactions between Elevated CO2 and Nitrogen in Transgenic Cotton Plants // J. Exp. Bot. 2002. V. 53. P. 323–331.
  14. Pettigrew W.T., Adamczyk J.J. Nitrogen Fertility and Planting Date Effects on Lint Yield and cryl ac (bt) Endotoxin Production // Agron. J. 2006. V. 98. P. 691–697.
  15. Chen D., Ye G., Yang C., Chen Y., Wu Y. The Effect of High Temperature on the Insecticidal Properties of Bt Cotton // Environ. Exp. Bot. 2005. V. 53. P. 333–340.
  16. Benedict J.H., Sachs E.S., Altman D.W., Deaton W.R., Kohel R.J., Berberich S.A. Field Performance of Cottons Expressing Transgenic Cry1A Insecticidal Proteins for Resistance to Heliothis virescens and Helicoverpa zea (Lepidoptera: Noctuidae) // J. Econ. Entomol. 1996. V. 89. P. 230–238.
  17. Jiang L., Duan L., Tian X., Wang B., Zhang H., Li Z. NaCl Salinity Stress Decreased Bacillus thuringiensis (Bt) Protein Content of Transgenic Bt Cotton (Gossypium hirsutum L.) Seedlings // Environ. Exp. Bot. 2006. V. 55. P. 315–320.
  18. Викторов А.Г. Тли и Bt-ратения // Защита растений. 2008. № 4. С. 16–17.
  19. Zwahlen C., Hilbeck A., Gugerli P., Nentwig W. Degradation of the Cry1Ab Protein within Transgenic Bacillus thuringiensis Corn Tissue in the Field // Mol. Ecol. 2003. V. 12. P. 765–775.
  20. Sims S.R., Holden L.R. Insect Bioassay for Determining Soil Degradation of Bacillus thuringiensis subsp. Kurstaki CryIA(b) Protein in Corn Tissue // Environ. Entomol. 1996. V. 25. P. 659–664.
  21. Saxena D., Flores S., Stotzky G. Bt Toxin Is Released in Root Exudates from 12 Transgenic Corn Hybrids Representing Three Transformation Events // Soil Biol. Biochem. 2002. V. 34. P. 133–137.
  22. Pagel-Wiedera S., Niemeyera J., Fischerb W.R., Gesslera F. Effects of Physical and Chemical Properties of Soils on Adsorption of the Insecticidal Protein (Cry1Ab) from Bacillus thuringiensis at Cry1Ab Protein Concentrations Relevant for Experimental Field Sites // Soil Biol. Biochem. 2007. V. 39. P. 3034–3042.
  23. Cortet J., Griffithsc B.S., Bohanecd M., Demsard D., Andersene M.N., Caulc S., Birchc A.N.E., Perninb C., Tabonef E., de Vaufleuryg A., Keh X.,. Kroghi P.H. Evaluation of Effects of Transgenic Bt Maize on Microarthropods in a European Multi-Site Experiment // Pedobiologia. 2007. V. 51. P. 207–218.
  24. Baumgarte S., Christoph C.T. Field Studies on the Environmental Fate of the Cry1Ab Bt-Toxin Produced by Transgenic Maize (MON810) and Its Effect on Bacterial Communities in the Maize Rhizosphere // Mol. Ecol. 2005. V. 14. P. 2539–2551.
  25. Wandeler H., Bahylova J., Nentwig W. Consumption of Two Bt and Six Non-Bt Corn Varieties by the Woodlouse Porcellio scaber // Basic Appl. Ecol. 2002. V. 3. P. 357–365.
  26. Bakonyi G., Szira F., Kiss I., Villanyi I., Seres A., Szekacs A. Preference Tests with Collembolas on Isogenic and Bt-Maize // Eur. J. Soil Biol. 2006. V. 42. P. 132–135.
  27. Zwahlen C., Hilbeck A., Nentwig W. Field Decomposition of Transgenic Bt Maize Residue and the Impact on Non-Target Soil Invertebrates // Plant Soil. 2007. V. 300. P. 245–257.
  28. Saxena D., Stotzky G. Bt Corn Has a Higher Lignin Content than Non-Bt Corn // Am. J. Bot. 2001. V. 88. P. 1704–1706.
  29. Poerschmann J., Gathmann A., Augustin J., Langer U., Gorecki T. Molecular Composition of Leaves and Stems of Genetically Modified Bt and Near-Isogenic Non-Bt Maize - Characterization of Lignin Patterns // J. Environ. Qual. 2005. V. 34. P. 1508–1518.
  30. Flores S., Saxena D., Stotzky G. Transgenic Bt Plants Decompose Less in Soil than Non-Bt Plants //Soil Biol. Biochem. 2005. V. 37. P. 1073–1082.
  31. Lee K.E. Earthworms. Their Ecology and Relationships with Soil and Land Use. Sydney: Academic, 1985. 411 p.
  32. Wheatley G.A., Hardman J.A. Insecticides and Chlorinated Hydrocarbons and Organic Phosphorus Compounds and Residues in Soil and Water, Carrots and Earthworms // Rep. Natl. Veg. Res. Stat. 1964. V. 15. P. 63–65.
  33. Ireland M.P. Heavy Metal Uptake and Tissue Distribution in Earthworms // Earthworm Ecology (From Darwin to Vermiculture) / Ed. Satchell J.E. London: Chapman and Hall, 1983. P. 247–265.
  34. Krivolutzkii D.A., Pokarzhevsky A.D., Viktorov A.G. Earthworm Populations in Soils Contaminated by the Chernobyl Atomic Power Station Accident, 1986- 1988 // Soil Biol. Biochem. 1992. V. 24. P. 1729–1731.
  35. Garrec J.P., Plebin R. Accumulation du luor dans les vers de terre vivant das des sol contamines // Environ. Pollut. Ser. B. 1984. V. 7. P. 97–105.
  36. Kreis B., Edwards P., Cuendet G., Tarradellas J. The Dynamics of PCB between Earthworm Population and Agricultural Soils // Pedobiologia. 1987. V. 30. P. 379–388.
  37. Marquenie J.M., Simmers J.W. A Method to Asses Potential Bioavailability of Contaminants // Earthworms in Waste and Environmental Management / Eds Edwards C.A., Neuhauser E.F. The Hague: SPB Academic, 1988. P. 367–376.
  38. Kuperman R. Acidic Deposition, Soil Invertebrates, Decomposition and Nutrient Dynamics on Oak-Hickory Forests of the Ohio Corridor Pollution Gradient // Air Pollutants and Forest Response. The Ohio Corridor Study / Ed. Loucks O.L. Indianopolis, Indiana: Hollcomb Res. Inst. Working Paper no. 134. 1990. P. 296–306.
  39. Edwards C.A., Bohlen P.J. The Effects of Toxic Chemicals on Earthworms // Review of Environmental Contamination and Toxicology. V. 125 / New York: Springer-Verlag, 1992. P. 23–99.
  40. Viktorov A.G. Diversity of Polyploid Races in the Family Lumbricidae // Soil Biol. Biochem. 1997. V. 29. 3/4. P. 217–221.
  41. Smirnoff W.A., Heimpel A.M. Notes on the Pathogenicity of Bacillus thuringiensis var. thuringiensis Berliner for the Earthworm, Lumbricus terrestris Linnaeus // J. Insect Pathol. 1961. V. 3. P. 403-408.
  42. Addison J.A., Holmes S.B. Effect of Two Commercial Formulations of Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki on the Forest Earthworm Dendrobaena octaedra // Can. J. Forest Res. 1996. V. 26. P. 1594-1601.
  43. Ahl Goy P., Warren G., White J., Privalle L., Fearing P. Interaction of an Insect Tolerant Maize with Organisms in the Ecosystem // Proc. Key Biosafety Aspects of Genetically Modified Organisms, 10–11 April, 1995. (Mitteilungen aus der Biologischen Bundesanstalt für Land- und Forstwirtschaft. V. 309). Berlin: Berlin-Dahlem, Blackwell, 1995. P. 50–53.
  44. Saxena D., Stotzky G. Bacillus thuringiensis (Bt) Toxin Released from Root Exudates and Biomass of Bt Corn Has No Apparent Effect on Earthworms, Nematodes, Protozoa, Bacteria, and Fungi in Soil // Soil Biol. Biochem. 2001. V. 33. P. 1225–1230.
  45. Zwahlen C., Hilbeck A., Howald R., Nentwig W. Effects of Transgenic Bt Corn Litter on the Earthworm Lumbricus terrestris // Mol. Ecol. 2003. V. 12. P. 1077–1086.
  46. Vercesi M.L., Krogh P.H., Holmstrup M. Can Bacillus thuringiensis (Bt) Corn Residues and Bt-Corn Plants Affect Life-History Traits in the Earthworm Aporrectodea caliginosa? // Appl. Soil Ecol. 2006. V. 32. P. 180–187.
  47. Roper T.J. The European Badger Meles meles: Food Specialist or Generalist? // J. Zool. (London). 1994. V. 234. P. 437–452.
  48. Liu X., Zhang Q., Zhao J., Cai Q., Xu H., Li J. Effect of the Cry1Ac Toxin of Bacillus thuringiensis on Microplitis mediator, a Parasitoid of the Cotton Bollworm, Helicoverpa armigera // Entomol. Exp. Appl. 2005. V. 114. P. 205–213.
  49. Lumbierres B., Albajes R., Pons X. Transgenic Bt-Maize and Rhopalosiphum padi (Hom., Aphididae) Performance // Ecol. Entomol. 2004. V. 29. P. 309–317.
  50. Wilson F.D., Flint M., Deaton W.R., Fishhoff D.A., Perlak F.J., Armstrong I.A., Fuches R.I., Berberich S.A., Parks N.I., Stapp B.R. Cotton Lines Containing a Bacillus thuringiensis Toxin to Pink Bollworm (Lepidoptera: Gelechiidae) and Other Insects // J. Econ. Entomol. 1992. V. 85. P. 1516–1521.
  51. Fitt G.P. An Australian Approach to IPM in Cotton: Integrating New Technologies to Minimize Insecticide Dependence // Crop Protect. 2000. V. 19. P. 793–800.
  52. Ma X.M., Liu X.X., Zhang Q.W., Zhao J.Z., Cai Q.N., Ma Y.A., Chen D.M. Assessment of Cotton Aphids, Aphis gossypii, and Their Natural Enemies on Aphid-Resistant and Aphid-Susceptible Wheat Varieties in a Wheat–Cotton Relay Intercropping System // Entomol. Exp. Appl. 2006. V. 121. P. 235–241.
  53. Pons X., Lumbierres B., Lуpez C., Albajes R. Abundance of Non-Target Pests in Transgenic Bt-Maize: A Farm Scale Study // Eur. J. Entomol. 2005. V. 102. P. 73–79.
  54. Yan F., Bengtsson M., Anderson P., Ansebo L., Xu C., Witzgall P. Antennal Response of Cotton Bollworm (Heliocoverpa armigera) to Volatiles in Transgenic Bt Cotton // J. Appl. Entomol. 2004. V. 128. P. 354–357.
  55. Ding Z.-Y., Xu C.-R., Wang R.-J. Comparison of Several Important Isoenzymes between Bt Cotton and Regular Cotton // Acta Ecol. Sinica. 2001. V. 21. P. 332-336.
  56. Zhang Y., Yang J., Guo Y. Changes of Condensed Tannins in Bt Cotton // Chin. Sci. J. 1999. V. 5. P. 1196–1198.
  57. Escher N., Kach B., Nentwig W. Decomposition of Transgenic Bacillus thuringiensis Maize by Microorganisms and Woodlice Porciello scaber (Crustacea: Isopoda) // Basic Appl. Ecol. 2000. V. 1. P. 161–169.
  58. Harwood J.D., Wallin W.G., Obrycki J.J. Uptake of Bt Endotoxins by Bontarget Herbivores and Higher Order Arthropod Predators: Molecular Evidence from a Transgenic Corn Agroecosystem // Mol. Ecol. 2005. V. 14. P. 2815–2823.